Amerikaanse octrooiaanvraag voor door vesicle gecoate vezels en methoden voor het maken en gebruiken van patentaanvraag (applicatie #20220018060 uitgegeven op 20 januari 2022) (2024)

Kruisverwijzing naar gerelateerde toepassingen

Deze aanvraag claimt het voordeel van de Amerikaanse voorlopige octrooiaanvraag nr. 62/767.990 (ingediend op 15 november 2018) en van U.S. Provisional Patent -aanvraag nr. 62/834,279 (ingediend op 15 april 2019);De gehele openbaarmakingen van beide worden hierin hierin ter verwijzing opgenomen voor alle doeleinden.

Verklaring over federale steun

Bepaalde hierin beschreven werk werd uitgevoerd met federale steun op grond van contracten NSF-DMR-1848573, NSF CBET-1512686 en NSF-HRD-1547848.De regering van de Verenigde Staten kan bepaalde rechten hebben in de hierin beschreven uitvindingen.Apparatuur die in sommige van de hierin beschreven experimenten werd gebruikt, werd verstrekt via NSF MRI Award No. DMR-1625733 en NASA Grant NNX1SAQ01A.

VELD

Deze openbaarmaking bevindt zich op het gebied van biologische blaasjes en door blaasjes gecoate vezels.

ACHTERGROND

Chemische verbindingen (bijvoorbeeld commercieel belangrijke verbindingen zoals geneesmiddelen, cosmetica en geuren) kunnen onder andere worden gecategoriseerd op basis van hun relatieve hydrofiliciteit of hydrofobiciteit.Hydrofiele stoffen bezitten over het algemeen een zekere mate van polariteit en zijn daarom oplosbaar in polaire oplosmiddelen zoals water, bepaalde alcoholen en waterige oplossingen.Hydrofiele stoffen zijn over het algemeen niet -polair en zijn daarom oplosbaar in niet -polaire oplosmiddelen zoals oliën, chloroform, isopropanol en methanol.

Verspreiding van hydrofiele materialen in waterige oplossing vindt relatief eenvoudig plaats, door oplossing en diffusie tot evenwicht, en kan worden verbeterd door vloeistofconvectie.Het beheersen van de spreidingspercentages of oplossing (d.w.z. het vaststellen van een uniforme afgifte voor een medicijn) kan echter uitdagingen opleveren.In dergelijke gevallen kan de controle van de afgiftesnelheid vaak worden bereikt door inkapseling (bijv. In een blaasje waarin de hydrofiele opgeloste stof wordt begrensd door een lipidemembraan), waardoor afgifte van de opgeloste stof wordt geactiveerd op specifieke tijdstippen.

Hydrofobe materialen daarentegen verspreiden zich niet spontaan in waterige oplossing.Integendeel, het gebruik van hydrofobe of amfifiele dispersiemiddelen is vereist om de verspreiding van hydrofobe materialen in waterige oplossingen te bevorderen.

Verschillende soorten blaasjes, die een hydrofiele kern (lumen) bevatten, omgeven door een hydrofoob membraan (lamella);hebben gebruik gevonden voor het opslaan en/of het verstrekken van zowel hydrofiele of hydrofobe stoffen, of beide.Hydrofiele stoffen kunnen worden gedispergeerd in de hydrofiele kern van een blaasje;en hydrofobe stoffen kunnen in het membraan worden geplaatst.

Gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) zijn gesloten fosfolipide dubbellaagse membranen (d.w.z. samengesteld uit een enkele dubbellaag) met diameters groter dan één micrometer¹, dus het nabootsen van de dimensies en compartimenteringseigenschappen van biologische cellulaire membranen.GUV's zijn nuttig in vitro -modellen voor biofysische experimenten^1-5, voor biomimetische medicijnafgifte en voor het ontwerpen van synthetische cellen^6-12.Lamellaire stapels fosfolipiden op vaste oppervlakken zoals glas of geruwde teflon spontaan in de loop van 24-36 uur in waterige oplossingen om gigantische blaasjes te vormen in een methode die bekend staat als zachte hydratatie^13-17.Vesiculatie kan ook worden bereikt door oscillerende elektrische velden die orthogonaal zijn op de lamellaire fosfolipide -stacks toe te passen in een lage ionsterkte -omgeving, in een proces dat bekend staat als elektroformatie¹⁸;en door lamellaire fosfolipidestapels op hydrogeloppervlakken (zoals agar, dextran en polyvinylalcohol) te hydrateren in een proces dat bekend staat als gelondersteunde hydratatie^19-24.In microfluïdische methoden vormen lipiden gedispergeerd in een niet-polair oplosmiddel een dubbele emulsie, een waterige fase binnen en een waterige fase buiten, die een dunne cirkelvormige laag van het niet-polaire oplosmiddel sandwist met behulp van een microfluïdisch co-flow apparaat.Terwijl het oplosmiddel verdampt, assembleren de lipiden zelf om een ​​dubbellaagmembraan te vormen met residueel oplosmiddel dat in het membraan achterblijft.Opgeloste opgeloste stoffen ("lading") in de waterige oplossing, zoals kleine moleculen, eiwitten en polysachariden kunnen worden ingekapseld in de groeiende GUV's^27-31.

Er zijn nadelen gekoppeld aan elk van de voorgaande procedures voor het samenstellen van GUV's.De zachte hydratatie is langzaam (24-48 uur), moet worden uitgevoerd op oppervlakken van glas of teflon, is beperkt tot het gebruik van negatief geladen lipiden en is gevoelig voor beweging of stroming tijdens het assemblageproces.

Elektroformatie vereist het gebruik van geleidende elektroden (zoals indiumtin-oxide-gecoate objectglaasjes, roestvrijstalen of platinadraden), vereist een bron van elektrisch vermogen en werkt niet efficiënt met geladen lipiden.

Voor gelondersteunde hydratatie is de oplossingssnelheid temperatuurgevoelig, waardoor het vesicle-montage bij lage temperaturen wordt uitgevoerd.Omdat hydrogels in water oplosbaar zijn, is bovendien de tijd waarin ze in contact kunnen blijven met een waterige oplossing beperkt, waardoor ook de tijdsduur beperkt waarin blaasjesassemblage kan worden uitgevoerd.Hoewel hydrogels kunnen worden verknoopt om hun oplosbaarheid in waterige oplossing te verminderen, verhoogt dit hun chemische complexiteit.

Hoewel microfluïdische methoden een precieze controle van de blaasjesgrootte bieden en vatbaar zijn om te gebruiken met veel verschillende soorten lipiden, zijn ze moeilijk op te schalen (voor productiedoeleinden) en laten grote hoeveelheden oplosmiddel achter in de membranen, waardoor problemen van potentiële toxiciteit worden verhoogd.

Aldus lijden bestaande methoden voor blaasjesassemblage aan de nadelen van kosten, tijd, toxiciteit, stroomvereisten en problemen bij het opschalen.Dienovereenkomstig is er behoefte aan nieuwe methoden voor blaasjesassemblage die goedkoop, niet-toxisch zijn, geen stroombron vereisen en gemakkelijk schaalbaar zijn.

SAMENVATTING

De huidige openbaarmaking biedt nieuwe methoden voor het samenstellen van blaasjes op vaste oppervlakken (bijv. Vezels), waarbij de blaasjes membranen van lamellaire fase -amfifielen van verschillende groottes omvatten.Ook worden nieuwe samenstellingen van materie bevat die een samenstelling van gedroogde amfifiele moleculen omvatten die lamellaire fasen vormen die de oppervlakken van cilindrische vezels en geweven materiaal besteden dat bestaat uit cilindrische vezels.De grootte van de vezels kan variëren van nanometer in diameter tot honderden micrometers in diameter.Het vezelmateriaal kan een natuurlijk materiaal zijn, zoals bijvoorbeeld katoen, zijde of wol;Een synthetisch materiaal zoals bijvoorbeeld nylon, polyester of glasvezel, of een geregenereerde vezels zoals rayon.Nanovezels, zoals traceerpapier, nanocellulosepapier of geregenereerde cellulosemembranen, kunnen ook worden gebruikt.Naast vezelachtige materialen kunnen blaasjes ook worden geproduceerd op metalen mazen, zoals bijvoorbeeld roestvrij staal (bijvoorbeeld staalwol) of koper.

Het amfifiele molecuul kan elke pure amfifiel of mengsel van amfifielen zijn die een lamellaire fase vormt.Een breed scala aan chemisch verschillende moleculen zoals bijvoorbeeld fosfolipiden, sfingolipiden, vetzuren, vetalcoholen en amfifiele blokcopolymeren;zijn in staat om lamellaire fasen te vormen.Amfifielen met een hydrofiele/lipofiele balans (HLB) verhouding van ongeveer 10 (waarbij de HLB -verhouding = 20m_H/M, en waar m_His de moleculaire massa van het hydrofiele gedeelte van het molecuul, en m is de moleculaire massa van het hele molecuul, wat een resultaat oplevert op de schaal van 0 tot 20), of met een pakkingparameter ˜1, samen in blaasjes wanneer aanwezig boven hunKritische aggregatieconcentratie (CAC).Verpakkingsparameter wordt berekend als v/a_Ol_C;waarin V het volume van de hydrofobe groep is, l_Cis de kritische lengte van de hydrofobe groep, en een_Ois het voorkeursgebied van de hydrofobe groep.De CAC -waarde is uniek voor elk molecuul en kan worden gemeten door veranderingen in dynamische lichtverstrooiing te meten als functie van de molecuulconcentratie.Verstrooiing neemt dramatisch toe wanneer de concentratie die aggregatie veroorzaakt, wordt bereikt.CAC -waarden kunnen ook worden gemeten door de oppervlaktespanning van de waterige oplossing te meten als een functie van de amfifiele concentratie.De oppervlaktespanning neemt af totdat de CAC is bereikt, waarna de oppervlaktespanning verzadigt.CAC -waarden zijn beschikbaar in de literatuur.

In de amfifiele lamellaire fase-gecoate vezels die hierin worden beschreven, produceert het composietmateriaal van de amfifielvezel spontaan spontaan blaasjes bij contact met een waterige oplossing.Afhankelijk van de verhouding van amfifielmassa tot het oppervlak van het substraat, kunnen de geproduceerde blaasjes unilamellair of multilamellair zijn.

De blaasjes kunnen aan de vezels worden bevestigd of kunnen uit de vezels worden vrijgegeven.Onder omstandigheden waarin er geen externe afschuifkrachten of vloeistofstroom over de gecoate vezel zijn, blijven veel van de blaasjes aan de vezel bevestigd.Wanneer de stroom optreedt als gevolg van externe krachten, zoals het wegvoeren van de vloeistof in de poreuze stof, beweging van de stof in de oplossing, of de acties van een pipet op de vloeistof, zijn blaasjes die aan de vezels waren bevestigd, in oplossing en reizenmet de stromende vloeistof.

Ook worden nieuwe methoden verstrekt voor het vormen van blaasjes die zijn samengesteld uit membranen van lamellaire fase -amfifielen van verschillende grootte.De methoden omvatten het coaten van de oppervlakken van vezels (bijv. Cilindrische vezels) of nanovezels met amfifiele moleculen, het drogen van de moleculen op de vezel en het incuberen van de gedroogde vezel in een waterige 'groeibuffer'.In bepaalde uitvoeringsvormen zijn de vezels gecoat met andere verbindingen (in water oplosbaar of in water onoplosbaar) voorafgaand aan de toepassing van een of meer amfifiele moleculen.In tegenstelling tot eerdere methoden, waarin verbindingen worden toegepast op stoffen, biedt de huidige openbaarmaking methoden waarin blaasjes die verbindingen bevatten, worden toegepast op stoffen (zie hieronder).Op deze manier kunnen zowel hydrofiele verbindingen (bijvoorbeeld in water oplosbare moleculen) als hydrofobe verbindingen (bijv. In water onoplosbare moleculen) worden toegepast op stoffen in de vorm van samengestelde blaasjes, waarin hydrofiele verbindingen zich in het vesicle-lumen bevindenen hydrofobe verbindingen bevinden zich in het blaasje membraan.

Coating van de vezel met een amfifiel wordt bereikt door de amfifiel in een oplosmiddel te verspreiden (bijv. Een vluchtig oplosmiddel, bijvoorbeeld chloroform, tolueen, benzeen, ethanol, isopropanol of water);vervolgens het oplosmiddel drogen (of het oplosmiddel laten drogen).Extra verbindingen (zowel in water oplosbaar als in water onoplosbaar) kunnen ook mede-dispereren in het oplosmiddel worden met de amfifiel en zullen ook de vezel samen met de lipiden bedekken.De lamelariteit van de blaasjes verkregen uit dit proces kan worden geregeld door de massa van amfifiel afgezet op de vezel, waarbij hogere massa wordt gecorreleerd met de vorming van meerdere (bijvoorbeeld geneste) membranen.

Methoden voor afgifte van blaasjes uit een door blaasjes gecoat substraat worden ook verstrekt.Voor door blaasjes gecoate substraten gemaakt door de hierin beschreven methoden, eenvoudige beweging in of via een waterige oplossing, of doorgang van een waterige oplossing over het door blaasjes gecoate substraat, of van een waterige oplossing door het substraat veroorzaaktsubstraat.In principe kan elk proces dat de stroom veroorzaakt (bijv. Thermische gradiënt, oppervlaktespanningsgradiënt, drukgradiënt, schuifspanningsgradiënt (bijvoorbeeld als gevolg van beweging) of bacteriebewegingen grenzend aan het substraat) kan blaasjes van het substraat afgeven.Optioneel kunnen vrijgegeven blaasjes worden geoogst uit oplossing en worden gebruikt voor verschillende toepassingen zoals elders hierin beschreven.

De huidige openbaarmaking biedt ook therapeutische en cosmetische composities met behulp van blaasjes-gecoate vezels zoals hierin bekendgemaakt.De huidige openbaarmaking biedt ook therapeutische en cosmetische methoden met behulp van de therapeutische en cosmetische samenstellingen die hierin worden beschreven.

Dienovereenkomstig is in bepaalde uitvoeringsvormen hierin een methode voor het maken van een door blaasjes gecoat substraat (bijv. Vezel), de methode die (a) een amfifiele molecuul in een vluchtig oplosmiddel omvat;(b) contact opnemen met het gedispergeerde amfifiele molecuul van (a) met een vezel;(c) het oplosmiddel verwijderen;en (d) het incuberen van de met amfifiel gecoate vezel in een eerste waterige oplossing.

Verwijdering van oplosmiddel, in stap (c) kan door verdamping zijn, niet -ondersteund of met behulp van een vacuümkamer.

Het amfifiele molecuul kan een fosfolipide zijn, een sfingolipide, een vetzuur, een ceramide, een vette alcohol, een diblock polymeer of een triblock polymeer.

In bepaalde uitvoeringsvormen kan het oplosmiddel chloroform, methanol, ethanol, isopropanol of water zijn.

In bepaalde uitvoeringsvormen heeft het substraat ten minste één element met een hoofdradius van kromming die niet nul is.De niet-nulstraal van kromming kan positief of negatief zijn

In bepaalde uitvoeringsvormen is het substraat een vezel.In aanvullende uitvoeringsvormen is de vezel een natuurlijk voorkomende vezels zoals bijvoorbeeld cellulose, zijde of wol.In uitvoeringsvormen waarin de vezel cellulose is, kan de cellulose katoen, hennep, jute, papyrus, papier of houtpulp zijn.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de vezel een semi-synthetische vezel zoals bijvoorbeeld Rayon.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de vezel een synthetische vezel zoals bijvoorbeeld nylon of polyester.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de vezel een synthetische anorganische vezels zoals bijvoorbeeld glasvezel.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de vezel een nanovezel zoals bijvoorbeeld traceringspapier, nanocellulosepapier of geregenereerd cellulosemembraan.In verdere uitvoeringsvormen wordt nanocellulosepapier gemaakt door oplossing te gieten van nanocellulosepulp.Nanohybride papieren, die verschillende concentraties nanocellulose bevatten (d.w.z. lager dan aanwezig in pure nanocellulose, maar meer dan aanwezig in ruwe cellulose) kunnen ook als substraten worden gebruikt.

In verdere uitvoeringsvormen is de vezel een metalen gaas, zoals roestvrij staal (bijvoorbeeld staalwol) of koper.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvatten methoden voor blaasjesassemblage verder de introductie van een verbinding in de eerste waterige oplossing (bijvoorbeeld water of buffer).Bij contact van het met amfifiel gecoate substraat met de samengestelde eerste waterige oplossing, wordt de verbinding in het waterige lumen van de aldus gevormde blaasjes gesekwestreerd, waardoor blaasjes die de verbinding bevatten als lading bevatten.

In bepaalde aanvullende uitvoeringsvormen wordt een tweede molecuul verspreid in het vluchtige oplosmiddel, samen met de amfifiel.Bij de vorming van blaasjes wordt het tweede molecuul gesekwestreerd in de hydrofobe kern van het amfifiele membraan, waardoor blaasjes die het tweede molecuul bevatten als vracht bevatten.

In bepaalde aanvullende uitvoeringsvormen wordt de verbinding afgezet op het substraat (bijv. Vezels of nanovezels) vóór of na het coaten van de vezels met amfifielen.Bij contact van het met amfifiel gecoate substraat met een waterige oplossing lost de verbinding op in de oplossing en wordt vastgelegd in de aldus gevormde blaasjes, waardoor blaasjes die de verbinding bevatten als lading bevatten.

Ook worden methoden verstrekt voor het produceren van een populatie blaasjes in een oplossing met hoge ionensterkte waarin de vorming van de blaasjes aanvankelijk wordt uitgevoerd bij lage ionsterkte, en vervolgens wordt de ionsterkte van de groeibuffer verhoogd.In bepaalde uitvoeringsvormen bevat een oplossing voor lage ionsterkte minder dan 50 mm, minder dan 40 mm, minder dan 30 mm, minder dan 25 mm, minder dan 20 mm, minder dan 15 mm, minder dan 10 mm of minder dan 5 mm monovalent zoutof het equivalent ervan.In bepaalde uitvoeringsvormen bevat een oplossing met hoge ionsterkte meer dan 5 mm, groter dan 10 mm, groter dan 15 mm, groter dan 20 mm, groter dan 25 mm, meer dan 30 mm, meer dan 40 mm, meer dan 50 mm, meer dan 50 mm,Meer dan 60 mm, groter dan 70 mm, groter dan 75 mm of meer dan 100 mm monovalent zout of het equivalent ervan.Het monovalente zout kan een kation, een anion of beide zijn.

Aanvullende methoden voor het produceren van blaasjes in een hoogzoutomgeving omvatten het coaten van het substraat, voorafgaand aan de vorming van de blaasjes, met een polymeer.Exemplarische polymeren omvatten hyaluronzuur, carboxymethylcellulose, ficoll, dextran, nucleïnezuren (bijv. DNA, RNA), polypeptiden en polysacchariden.

Ook worden methoden aangeboden voor het vormen van blaasjes op een substraat, waarbij de blaasjes een hydrofiele verbinding in het blaasje lumen omvatten, de methode die (a) een oplossing van de hydrofiele verbinding op het substraat omvat;(b) het toestaan ​​van de oplossing op het substraat drogen;(c) een lipide op het substraat toepassen;en (d) het plaatsen van het met lipide gecoate substraat in een waterige oplossing.In bepaalde uitvoeringsvormen is de oplossing van de hydrofiele verbinding een waterige oplossing.In aanvullende uitvoeringsvormen is het substraat een cellulose -nanopaper.In andere uitvoeringsvormen is het substraat traceringspapier.In aanvullende uitvoeringsvormen is het lipide DOPC.

Ook worden verstrekt blaasjes gemaakt door een methode die (a) omvat die een amfifiele molecuul verspreiden in een vluchtig oplosmiddel;(b) contact opnemen met het gedispergeerde amfifiele molecuul van (a) met een substraat (bijvoorbeeld een vezel);(c) het oplosmiddel verwijderen;en (d) het incuberen van het met amfifiel gecoate substraat in een eerste waterige oplossing.De blaasjes kunnen unilamellair of multilamellair zijn (bijv. Bilamellaire, trilamellaire of oligolamellaire).

Het amfifiele molecuul kan een fosfolipide zijn, een sfingolipide, een vetzuur, een ceramide, een vette alcohol, een diblock polymeer of een triblock polymeer.

In bepaalde uitvoeringsvormen kan het oplosmiddel chloroform zijn, methanol.ethanol, isopropanol of water.

In aanvullende uitvoeringsvormen is de vezel een natuurlijk voorkomende vezels zoals bijvoorbeeld cellulose, zijde of wol.In uitvoeringsvormen waarin de vezel cellulose is, kan de cellulose katoen, hennep, jute, papyrus, papier of houtpulp zijn.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de vezel een synthetische vezel zoals bijvoorbeeld nylon, polyester of rayon.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de vezel een nanovezel zoals bijvoorbeeld traceringspapier, nanocellulosepapier of geregenereerd cellulosemembraan.

In verdere uitvoeringsvormen is de vezel een metalen gaas, zoals roestvrij staal (bijvoorbeeld staalwol) of koper.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvatten blaasjes ook een of meer verbinding (en) binnen het lumen van de blaasjes.Dergelijke verbindingen kunnen bijvoorbeeld een therapeutisch molecuul zijn (bijv. Een medicijn, anesthetisch, antibioticum, analgeticum) of een of meer cosmetische moleculen (bijv. Anti-verouderingsmiddelen zoals retinol, antiperspiranten, geuren).

In bepaalde aanvullende uitvoeringsvormen omvatten blaasjes ook een of meer verbinding (en) in het membraan van de blaasjes.Dergelijke verbindingen kunnen bijvoorbeeld een therapeutisch molecuul zijn (bijv. Een medicijn, anesthetisch, antibioticum, analgeticum) of een of meer cosmetische moleculen (bijv. Anti-verouderingsmiddelen zoals retinol, antiperspiranten, geuren).Blaasjes kunnen ook structuren omvatten zoals nanodeeltjes, colloïdale deeltjes en virussen.

Ook zijn er methoden voor het vrijgeven van blaasjes van een door blaasjes gecoat substraat, bestaande uit vloeistofstroom over of door het substraat.

Ook worden methoden verstrekt voor het maken van een met amfifiel gecoat substraat, de methoden die: (a) een amfifiel molecuul in een vluchtig oplosmiddel verspreiden;(b) contact opnemen met het gedispergeerde amfifiele molecuul van (a) met het substraat;en (c) het oplosmiddel verwijderen.Amfiphile-gecoate substraten gemaakt door de voorgaande methode worden ook verstrekt.

Ook zijn therapeutische samenstellingen die met blaasjes gecoate vezels omvatten, zoals hierin beschreven, waarbij de met vesicle gecoate vezels verder een of meer therapeutische moleculen omvatten.Het therapeutische molecuul (en) kan in het lumen van het blaasje en/of in het membraan van het blaasje verblijven en kan bijvoorbeeld een medicijn, een anesthetiek, een antibioticum of een analgeticum zijn.

Ook worden cosmetische samenstellingen gegeven die met vesicle gecoate vezels omvatten zoals hierin beschreven, waarbij de met vesicle gecoate vezels verder een of meer cosmetische moleculen omvatten.De cosmetische molecule (s) kan in het lumen van het blaasje en/of in het membraan van het blaasje verblijven en kan bijvoorbeeld een anti-verouderingsmiddel zijn zoals retinol, een antiperspirant of een geur.

Ook worden therapeutische methoden verstrekt die gebruik maken van de therapeutische samenstellingen die hierin worden beschreven.

Ook worden cosmetische methoden aangeboden met behulp van de hierin beschreven cosmetische composities.

In bepaalde uitvoeringsvormen worden methoden voor het toepassen van een therapeutische samenstelling op een onderwerp verstrekt, waarbij de methoden contact opnemen met het onderwerp met een therapeutische samenstelling zoals hierin bekendgemaakt.

In bepaalde uitvoeringsvormen worden methoden voor het toepassen van een cosmetische samenstelling op een onderwerp verstrekt, waarbij de methoden contact opnemen met het onderwerp met een cosmetische samenstelling zoals hierin bekendgemaakt.

Ook worden verstrekt door blaasjes gecoate substraten, zoals hierin beschreven, voor gebruik bij het maken van een medisch apparaat (bijvoorbeeld een verband, stent, zetpil of pessarium).

Ook worden verstrekt door blaasjes gecoate substraten, zoals hierin beschreven, voor gebruik bij het maken van een cosmetisch apparaat (bijvoorbeeld een verband of een anti-transpirant-patch).

Methoden voor het beheersen van vesiculatie, nadat een amfifiel is toegepast op of afgezet op een substraat, worden ook verstrekt.In bepaalde uitvoeringsvormen wordt vesiculatie geregeld door de osmolariteit van de groeibuffer.Dienovereenkomstig worden met amfifiel gecoate substraten bereid door (a) een amfifiel molecuul te verspreiden in een vluchtig oplosmiddel;(b) contact opnemen met het gedispergeerde amfifiele molecuul van (a) met het substraat;(c) het oplosmiddel verwijderen;en (d) het incuberen van het met amfifiel gecoate substraat in een eerste waterige oplossing die een opgeloste osmoliet bevat, waarbij de osmolariteit van de eerste oplossing vesiculatie voorkomt.Vesiculatie kan ze worden geïnduceerd door de eerste oplossing te verdunnen zodat de osmolariteit van de eerste oplossing vesiculatie mogelijk maakt;of door het met amfifiel gecoate substraat over te dragen naar een oplossing met een osmolariteit die vesiculatie mogelijk maakt.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de osmoliet ficoll 400. Concentraties van Ficoll 400 die een osmotische druk bieden van meer dan 1 kPa (bijvoorbeeld 2 mm of hoger) vesiculatie voorkomen.Verdunning van de oplossing zodanig dat de ficoll -concentratie wordt verminderd tot 0,7 mm of minder;of het overbrengen van het met amfifiel gecoate substraat naar een oplossing met een ficoll-concentratie van 0,7 mM of minder, zorgt ervoor dat vesiculatie optreden.

Samenstellingen die een met amfifiel gecoat substraat omvatten in een oplossing met een osmolariteit die vesiculatie voorkomt, worden ook verstrekt.Vesiculatie kan in deze samenstellingen worden geïnduceerd door de oplossing te verdunnen tot een lagere osmolariteit die vesiculatie mogelijk maakt;of door het met amfifiel gecoate substraat over te dragen naar een andere oplossing met een osmolariteit die vesiculatie mogelijk maakt.

Bij aanvullende uitvoeringsvormen wordt vesiculatie geregeld door de temperatuur van de groeibuffer.Dienovereenkomstig worden met amfifiel gecoate substraten bereid door (a) een amfifiel molecuul te verspreiden in een vluchtig oplosmiddel;(b) contact opnemen met het gedispergeerde amfifiele molecuul van (a) met het substraat;(c) het oplosmiddel verwijderen;en (d) het incuberen van het met amfifiel gecoate substraat in een eerste waterige oplossing met een temperatuur die lager is dan de overgangstemperatuur van de amfifiel.Vesiculatie kan vervolgens worden geïnduceerd door de temperatuur van de eerste oplossing te verhogen tot een temperatuur die groter is dan de overgangstemperatuur van de amfifiel;of door de met amfifiel gecoate vezel over te brengen naar een omgeving (bijv. Een oplossing) met een temperatuur die groter is dan de overgangstemperatuur van de amfifiel.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de amfifiel 1,2-dipentadecanoyl-Sn-glycero-3-fosfocholine en de temperatuur die lager is dan de overgangstemperatuur van de amfifiel, die vesiculatie voorkomt, is een temperatuur van 35 ° C. of lager.Het verhogen van de temperatuur van de oplossing tot een temperatuur boven 35 ° C, of ​​het overbrengen van het met amfifiel gecoate substraat naar een omgeving met een temperatuur die groter is dan 35 ° C, induceert vesiculatie.

Samenstellingen die een met amfifiel gecoat substraat omvatten in een oplossing met een temperatuur die vesiculatie voorkomt (d.w.z. een temperatuur onder de overgangstemperatuur van de amfifiel) worden ook verstrekt.Vesiculatie kan in deze samenstellingen worden geïnduceerd door de oplossing te verwarmen tot een temperatuur die boven de overgangstemperatuur van de amfifiel ligt, of door de met amfifiel gecoate vezel over te brengen naar een omgeving (bijvoorbeeld een oplossing) met een temperatuur die groter is dan de overgangTemperatuur van de amfifiel.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

Voor de doeleinden van de huidige openbaarmaking verwijzen de termen "amfifiel", "amfiphilisch molecuul" en "amfipathisch molecuul" allemaal naar een molecuul dat een of meer hydrofobe gebieden bevat, evenals een of meer hydrofiele gebieden, zodat een populatie van dergelijkeMoleculen is in staat om lamellaire structuren in waterige oplossing te vormen.

De term "blaasje" of "liposoom" verwijst naar een structuur die een waterig centrum omvat begrensd door een of meer membranen (of lamellen).Een blaasje kan worden begrensd door een enkel membraan (een unilamellair blaasje), door twee (concentrische) membranen (een bilamellaire blaasje), door drie membranen (een trilamellaire blaasje) of meer.Blaasjes kunnen bolvormig of langwerpig zijn (d.w.z. met de vorm van een vaste ovaal) in vorm.Polymere structuren die meerdere bolvormige blaasjes omvatten die in een lineair polymeer zijn gerangschikt, kunnen ook worden gevormd met behulp van de hierin beschreven methoden.

De termen "substraat" en "vezels" verwijzen door elkaar naar vezelachtige vaste stoffen zoals bijvoorbeeld cellulose, synthetische vezels en metaalmazen.In de hierin beschreven methoden worden amfifiele moleculen op een substraat afgezet als onderdeel van het proces voor het vormen van blaasjes.

De termen "nanocellulose", "nanopaper" en "nanostructureerde cellulose" verwijzen naar een substraat gemaakt van cellulose -nanofibrillen, bijvoorbeeld door oplossing te gieten of filtratie van nanocellulosepulp.

De huidige openbaarmaking biedt, onder andere, nieuwe methoden voor de snelle productie van blaasjes met behulp van stoffen (zoals zijde, katoen, rayon, polyester, nylon of staalwol, bijvoorbeeld) en vellen (zoals nanopaper, cellulose of dialysis membranen, bijvoorbeeld) die in staat zijn om blaasjes te vormen met behulp van zowel positief als negatief geladen lipiden, vereisen geen vermogen en hebben minimale toxiciteit.Het proces kan als volgt worden samengevat: (1) Een stof of plaat is gecoat met een geschikte amfifiel zoals een vetzuur, een fosfolipide of een amfifiel polymeer (bijv. Een diblokcopolymeer of een triblokcopolymeer) en (2) de droge, met amfifiel gecoate stof of vel wordt in contact geplaatst met een waterige oplossing om de vorming van blaasjes te induceren.Extra amfifielen omvatten catanionische oppervlakteactieve stoffen, bolaforme amfifielen en archael -lipiden.

Bij aanvullende methoden wordt afgifte en oogsten van blaasjes uit met vesicle gecoate substraten bereikt door vloeistof (bijvoorbeeld een waterige oplossing) stromen over of door het substraat.

De bekendgemaakte methoden bieden de volgende voordelen ten opzichte van bestaande methoden voor de vorming van blaasjes: (1) Er zijn geen speciaal voorbereide substraten vereist, omdat stoffen en papieren vellen direct beschikbaar zijn;(2) Het is snel en efficiënt: blaasjes kunnen binnen een uur worden verkregen en zijn vrij van verontreiniging door substraat en oplosmiddelen;en (3) het proces is gemakkelijk schaalbaar omdat het geen gebruik van stroom of speciale apparatuur vereist.

Aangezien de methoden niet het gebruik van stroom vereisen, kunnen substraten (zoals bijvoorbeeld stoffen en vellen zoals hierboven beschreven) vooraf worden gecoat met amfifiel in een fabriek of andere productielocatie en vervolgens droog naar het gebruikspunt worden verzonden, waaraan,, bijvoorbeeld, kunnen blaasjes worden geoogst (door het met amfifiel gecoate substraat aan water of een waterige oplossing bloot te stellen) of de door blaasjes gecoate substraten kunnen worden gebruikt voor bijvoorbeeld cosmetische of therapeutische toepassingen.De methoden voor de vorming van blaasjes zijn compatibel met de huidige productiepraktijken en zijn gemakkelijk vatbaar voor opschalen en kwaliteitscontrole.Amfifielen kunnen bijvoorbeeld op papier worden afgedrukt, verwant aan het afdrukken van inkt, door machines voor het maken van vellen en papiercoating aan te passen om amfifielen continu over grote gebieden van papier en stof af te zetten.Op de gebruiksplaats zou een andere uitvoeringsvorm inhouden dat de amfifielen worden geleverd in de vorm van een poeder dat kan worden opgelost in een geschikt oplosmiddel op de plaats van gebruik voorafgaand aan depositie op het substraat.Een andere uitvoeringsvorm op de gebruikslocatie zou inhouden dat de amfiphile vooraf is opgelost in een geschikt oplosmiddel met een geschikt dispersie-apparaat zoals een aerosol blik, een verstuiver of pipet;waardoor de amfifiel op het substraat kan worden afgezet voorafgaand aan de groei van de blaasjes.

Blaasjes

Blaasjes of liposomen, zoals hierin beschreven, bevatten een hydrofiel lumen en een hydrofoob membraan rond het lumen.Biologische membranen bestaan ​​vaak uit een herhalende opstelling van amfifiele (of amfipathische) moleculen;d.w.z. moleculen die zowel hydrofiele als hydrofobe delen omvatten, vaak afgezet aan tegenovergestelde uiteinden van het molecuul (bijvoorbeeld fosfolipiden).In waterige oplossingen rangschikken amfipathische moleculen zich in een dubbellaag zodat hun hydrofobe delen tegenover elkaar staan ​​(die een hydrofobe kern van het membraan vormen) en hun hydrofiele delen naar buiten gericht naar het oplosmiddel en naar binnen naar een waterige lumen.De hydrofobe kern van de dubbellaag is in staat om geladen moleculen (bijvoorbeeld ionen) en gehydrateerde macromoleculen uit te sluiten, terwijl doorgang van water en kleine hydrofobe moleculen mogelijk is.

De hierin beschreven blaasjes zijn nuttig, omdat hydrofobe moleculen (bijv. Geneesmiddelen) kunnen worden opgelost of gedispergeerd in de hydrofobe kern van het membraan.Blaasjes kunnen vervolgens worden verspreid in bulkoplossing, waardoor de beschikbaarheid van een hydrofobe geneesmiddel in het membraan van een blaasje wordt gedispergeerd, vergeleken met de beschikbaarheid van hetzelfde hydrofobe geneesmiddel toegediend in niet-vesiculaire vorm.Bovendien kunnen blaasjes samensmelten met het plasmamembraan van een cel (bijv. Een zoogdiercel, een plantencel, een bacteriële cel of een schimmelcel), waardoor lading wordt afgedragen (ofwel een hydrofiel molecuul in het lumen of een hydrofobe molecule ingebrachtin het membraan) naar de cel.Schimmelcellen, bepaalde bacteriecellen en plantencellen bezitten celwanden buiten hun plasmamembraan;Methoden voor het overtreden van cellenwanden, waardoor toegang wordt geboden tot het plasmamembraan, zijn bekend in de kunst.Bovendien kan een receptor worden opgenomen in het membraan van het blaasje om het blaasje op een specifieke locatie te richten (bijvoorbeeld lichaamsweefsel, celtype).Receptoren voor membraaneiwitten zijn bekend in de kunst;Om slechts één voorbeeld te geven, wordt de receptor voor vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) tot overexpressie gebracht op het oppervlak van bepaalde kankercellen;Dienovereenkomstig kunnen VEGF- of anti-VEGF-receptorantilichamen worden opgenomen in het membraan van een blaasje om het blaasje te richten op een cel die VEGF-receptoren in zijn celmembraan bevat.Positief geladen moleculen kunnen worden opgenomen in het polaire gedeelte van het membraan, dat ook zal helpen bij de fusie van het blaasje met het negatief geladen membraan van zoogdiercellen.

Naast het in staat zijn om hydrofobe moleculen in het membraan op te lossen, kunnen blaasjes ook hydrofiele moleculen in hun lumen inkapselen en oplossen.In deze uitvoeringsvormen wordt ingekapseld hydrofiel materiaal beschermd tegen de omgeving (bijvoorbeeld bloed, weefselvloeistof, speeksel, maagzuur, enz.) Tot het uit de blaasjes wordt afgegeven.Verstoring van het blaasje om de luminale inhoud van de luminale af te geven, kan worden bereikt door fysische en chemische gradiënten toe te passen op de blaasjes, zoals een gradiënt in osmotische druk, een gradiënt in pH en/of een gradiënt in temperatuur, die de blaasjes zullen veroorzakenom te barsten en hun inhoud vrij te geven.

Optimale omstandigheden voor groei zullen variëren met het type amfifiel dat wordt gebruikt om het blaasje te assembleren, en kan de initiële oppervlakteconcentratie van de amfifiel-, pH- en ionensterkte van de groeibuffer en de tijd en temperatuur van incubatie in groeibuffer omvatten.Afhankelijk van de assemblagecondities vertonen blaasjes amfifielspecifieke variatie in grootte, lamelariteit en structuur.

Amfifiele moleculen

Amfifiele moleculen (ook bekend als amfipathische moleculen) zijn verbindingen die een of meer hydrofobe gebied (en) en een of meer hydrofiel gebied (s) binnen hun moleculaire structuur bevatten.Voorbeeldige amfiphilische moleculen omvatten fosfolipiden, vetzuren, sfingolipiden, ceramiden, vetalcoholen, quaternaire ammonium -oppervlakteactieve stoffen en amfifiele polymers zoals bijvoorbeeld amfiphilische blokkers) copolymers, amfiphilic trriblock -trrieblockcopolymers), amfiphilic trriblock -trrieblockcopolymers).Aanvullende voorbeeldige amfifiele moleculen omvatten oliezuur, fosfatidylcholine, fosfatidylglycerol, fosfatidylserine, fospatidinezuur, fosfatidylethanolamine, DOPG, dops, dopc, dopc, dopc, dppc, dopa, dotap, pop, pop, sopc, sopc, sopc, sopg, sopg, bijvoorbeeld.Biologische extracten die amfifiele moleculen bevatten, omvatten lecithine (bijv. Soja -lecithine, ei -lecithine), polaire extracten van elk dierproduct dat cellen of cellulaire organellen bevat, zoals, zoalsE colitotaal extract,E coliPolair extract, hartpolair extract, leverpolair extract, soja -poolextract, ei, totale extract van de hersenen en gist polair extract.Verdere voorbeeldige amfifielen omvatten catanionische oppervlakteactieve stoffen, bolaforme amfifielen en archael -lipiden.

Extra voorbeeldige amfiphiles omvatten DOPC: Topfluor-cholesterol, DOPC: Rhodamine-DPPE, ESM: DOPC: Chol: Topfluor-cholesterol: Rhodamine-Dppe, DPPC: Topfluor PC, DOP: Topfluor-cholesterol, didodecyldimethylammoniumbromide (DDAB), myristolzuur, dodecyltrimethylammoniumbromide (DTAB) en didodecyldimethylammoniumbromide (DDAB).

Substraten

Met behulp van de hierin beschreven methoden kunnen blaasjes (bijv. Liposomen, GUV's) worden afgezet op een substraat en kunnen de door vesicle gecoate substraten worden gebruikt zoals elders hierin bekendgemaakt.Substraten voor gebruik in de bekendgemaakte methoden omvatten, maar zijn niet beperkt tot vezels (bijv. Gebogen vezels, cilindrische vezels, afgeplatte cilindrische vezels, golvende cilindrische vezels of lineaire poly-bierachtige vezels) en metaalmesh (bijv. Mesh (bijv. Mesh (bijv. Mesh (bijv. Mesh (bijv.wol).Vezels omvatten natuurlijk voorkomende vezels, zoals cellulose, zijde en wol.Cellulosevezels omvatten papyrus, papier, houtpulp, katoen, hennep en jute.Vezels omvatten ook synthetische vezels, zoals bijvoorbeeld nylon en polyester en semi-synthetische vezels zoals bijvoorbeeld Rayon.Vezels omvatten ook anorganische synthetische vezels zoals bijvoorbeeld glasvezel.Vezels omvatten ook nanovezels, zoals traceerpapier, nanocellulosepapier (d.w.z. nanostructureerd cellulosepapier) of geregenereerd cellulosemembraan (bijv. Dialysisembraan).

Vezels kunnen ook driedimensionale weefselkweeksteigers bevatten, en verbanden zoals polycaprolacton (PCL) nanovezels en collageen nanovezels.Collageen kan worden afgeleid van de staart van de ratten en gedecellulariseerd rundermyocardium.Nanocellulose kan worden afgeleid van, bijvoorbeeld plantenbiomassa, bacteriën, algen en tunicaten.Vezels kunnen willekeurig worden verstrikt (bijv. Papier), geweven (bijv. Stoffen zoals katoen), niet-geweven (bijvoorbeeld vilt) of uitgelijnd in bepaalde richtingen.Voor de doeleinden van deze openbaarmaking worden de termen "vezels" en "stof" door elkaar gebruikt.

Cellulose is een overvloedig biopolymeer dat zowel hygroscopisch als hydrofiel is, maar het is in wezen onoplosbaar in water en de meeste organische oplosmiddelen, zelfs bij verhoogde temperaturen.Zoals hierin bekendgemaakt, biedt hydraterende gedroogde lipidefilms op cellulose een gemakkelijke route naar het bereiden van blaasjes (bijv. Gigantische liposomen) die overwegend unilamellair zijn;d.w.z. gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's).Zonder te wensen te zijn gebonden aan theorie, is het waarschijnlijk dat kromming van cellulosevezels, samen met de zwelling van cellulosevezels bij blootstelling aan water, een drijvende kracht biedt voor het scheiden van de lamellen, aanwezig in gehydrateerde meerlagige lipide -stacks, in unilamellaire vesicles.Het gebruik van cellulose als een substraat voor de productie van blaasjes, zoals liposomen, is een aanzienlijk afwijking van de huidige methoden (met behulp van bijvoorbeeld teflon, elektrische velden, enz.), En vereenvoudigt procedures voor het fabriceren van biologische blaasjes.

Zoals hierin beschreven, is de kromming van de elementen (bijv. Vezels, fibrillen) in een substraat positief gecorreleerd met de opbrengst van blaasjes verkregen op dat substraat met behulp van de hierin beschreven methoden.Platte substraten zoals glas, dat een krommingstraal heeft = 0, bieden een lage opbrengst aan blaasjes.Voor een uiterlijk gebogen lineaire vezels of fibril, die een hogere blaasjesopbrengst biedt, is een hoofdradius van kromming> 0.Vezels kunnen ook naar binnen worden gebogen (d.w.z. concave of ingeklapte vezels), in welk geval de kromtestraal <0 is.Bovendien zal een vezel die een verzameling bollen bevat (bijv. Een reeks bollen), die twee belangrijkste niet-nul-stralen van kromming zou hebben, ook hoge opbrengsten van blaasjes opleveren.

In bepaalde uitvoeringsvormen hebben vezels of fibrillen afmetingen (bijvoorbeeld lengte, diameter) in het nanometerbereik;bijv. Nanovezels of vezels op nanoschaal.

In bepaalde uitvoeringsvormen wordt nanocellulosepapier gebruikt als een substraat.Van planten afgeleide cellulosevezels hebben een hiërarchische structuur.Smook, G. Handboek voor pulp- en papieren technologen.(Tappi Press, 2016).Cellulosevezels zijn tientallen micrometers in diameter en zijn samengesteld uit microfibrillen die zelf bundels van waterstofgebonden nanofibrillen bevatten met een diameter van ongeveer 5-60 nm.Fig.19, zie Klemm et al.(2011)Angew.Chemie-Int.Ed.50: 5438-5466.Chemische hydrolyse en hogedruk mechanische homogenisatie defibrilleren planten afgeleide cellulosevezelpulp in nanocellulosepulp.Klemm et al., Supra.Nanocellulose -pulp kan worden omgezet in nanocellulosepapier door bijvoorbeeld oplossing gieten of filtratie.Nanocellulose kan ook worden verkregen uit cellulose-producerende bacteriën, zij het in kleinere hoeveelheden en tegen hogere kosten.Klemm et al., Supra.

Cellulose -nanofibrillen kunnen verkregen uit cellulosevezels door mechanische homogenisatie met behulp van afschuiving, druk en/of chemische behandelingen.Zie bijvoorbeeld Li Y-Y et al.(2018).Beoordeling van recente ontwikkeling bij voorbereiding, eigenschappen en toepassingen van op cellulose gebaseerde functionele materialen.Int J Polym Sci.;2018: 1-18.doi: 10.1155/2018/8973643.Het water mag bij kamertemperatuur verdampen, waardoor een dun vel nanopaper achterblijft.De nanopaper wordt spoelt en grondig gereinigd met chloroform en vervolgens water.Als alternatief commercieel traceringspapier, dat ook mechanisch en chemisch is verfijnd om een ​​dicht fibrillair oppervlak te verkrijgen, kan worden gebruikt.

Aanvullende voorbeeldige substraten omvatten driedimensionale weefselkweeksteigers, verbanden zoals polycaprolacton (PCL) nanovezels, collageen nanovezels en extracellulaire matrixvezels (d.w.z. decellulaire extracellulaire matrix).

Vesicle -vorming

Blaasjes worden gevormd door een dispersie van een amfifiele molecuul toe te passen op een substraat (bijvoorbeeld een vezel zoals cellulose) en de gedispergeerde amfifiel op het substraat te laten drogen;Bijv. door verdamping van het oplosmiddel waarin de amfifiel wordt verspreid, gevolgd door contact van het gedroogde, met amfifiel gecoate substraat met een waterige oplossing (d.w.z. een "groeibuffer").Na afzetting van amfifiel op een substraat en verdamping van het oplosmiddel vormt de amfifiel afzettingen op het oppervlak van het substraat.Contact van het met amfifiel gecoate substraat met water (of met een waterige oplossing) zorgt ervoor dat de amfifiele afzetting herschikt in stapels die blaasjes vormen.

Elk oplosmiddel waarin een bepaalde amfifiel kan worden verspreid, kan worden gebruikt.Het is eenvoudig om te bepalen of een bepaald oplosmiddel in staat is om een ​​bepaalde amfifiel te verspreiden.Geschikte oplosmiddelen waarin een amfifiel kan worden verspreid, omvatten zowel polaire als niet -polaire oplosmiddelen.Een geschikt oplosmiddel kan bijvoorbeeld een alkaan zijn, zoals bijvoorbeeld pentaan, hexaan of octaan;een aromatisch oplosmiddel zoals bijvoorbeeld chloroform, tolueen, benzeen, koolstoftetrachloride, aceton, methyleenchloride, xyleen of squaleen;een alcohol, zoals bijvoorbeeld methanol, ethanol, isopropanol en hogere alcoholen;Aceton of water.

Blaasjes gemaakt door de hierin beschreven methoden kunnen unilamellair zijn of meerdere (bijvoorbeeld concentrische) membranen kunnen omvatten.De mate van lamelariteit (d.w.z. unilamellaire, multilamellaire) van blaasjes gemaakt door de hierin beschreven methoden (of de vorming van andere structuren zoals multivesiculaire structuren en amfifiele druppeltjes) is gecorreleerd met de dikte van de laag van amfifiel die wordt afgezet op de substraat die op de substraat wordt afgezet die op de substraat wordt afgezet,.Over het algemeen worden unilamellaire blaasjes geproduceerd uit amfiphile-laagdiktes van 1-50 bilagenstapels;overeenkomend met 10-100 microgram amfifiel aangebracht op een cirkelvormige schijf van substraat met een diameter van 9,5 mm.De vorming van multilamellaire blaasjes vereist in de volgorde van 100 of meer dubbellagende stapels amfifiel op het substraat;overeenkomend met een massa amfifiel van 100 microgram of meer toegepast op een diameter van een diameter van 9,5 mm van substraat.Deze richtlijnen kunnen worden geëxtrapoleerd, door de bovenstaande richtlijnen om te zetten in amfifielmassa/substraatoppervlakwaarden, om richtlijnen te bieden voor de vorming van uni- en multi-lamellaire blaasjes op niet-circulaire substraten.

Groeibuffers

De vorming van blaasjes op lipide- of amfifiel gecoate substraten treedt op wanneer het gedroogde, gecoate substraat wordt geplaatst in een waterige 'groeibuffer'.Keuze van groeibuffer hangt af van factoren zoals bijvoorbeeld de blaasjesgrootte, blaasvrachtvracht en de aard van het lipide of amfifiele molecuul dat wordt gebruikt om het membraan van het blaasje te assembleren.Groeibuffers kunnen variëren van water (bijv. Destilleerd water, ultrapure water) tot suikeroplossingen (bijv. Sucrose) tot ionische buffers zoals bijvoorbeeld tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-Ethanesulfonzuur (HEPES) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).Biologische vloeistoffen zoals bijvoorbeeld bloed, plasma, serum, tranen, urine en speeksel kunnen ook worden gebruikt als groeibuffers.

Blaasjesbelasting

Wanneer verspreid in groeibuffer, worden macromoleculen zoals eiwitten en polysachariden (d.w.z. lading) spontaan opgenomen uit oplossing in het lumen van het blaasje.Voor bepaalde amfifielen kunnen verhoogde temperaturen (d.w.z. temperaturen boven kamertemperatuur) nodig zijn voor blaasjesmontage.In deze gevallen kan de vorming van de blaasjes tijdelijk worden ontkoppeld door het laden van lading door substraat te coaten met amfifiel bij verhoogde temperatuur (bijv. 80 ° C) in afwezigheid van lading, het afkoelen van het met amfifiel gecoate substraat tot kamertemperatuur of onder, en contact opmet amfifiel gecoat substraat met een waterige oplossing van de vrachtmolecuul (s).

Laden van lading van oplossing in blaasjes is een diffusiegedreven component;afhankelijk van de concentratie van het vrachtmolecuul, de diffusiecoëfficiënt van het vrachtmolecuul en de grootte van de blaasjes.In bepaalde uitvoeringsvormen is de ladingsconcentratie in de laadoplossing in de volgorde 1 μm.Bij aanvullende uitvoeringsvormen kan de concentratie van vrachtmolecuul tussen 0,5 en 2 μm, of tussen 0,1 en 5 μm, of tussen 1 en 10 μm zijn.Voor een vrachtmolecuul met een diffusiecoëfficiënt van 10⁻¹¹M²S⁻¹, De karakteristieke tijd voor diffusie van het molecuul in blaasjes is ongeveer 10 sec.In bepaalde uitvoeringsvormen kunnen laadtijden van 10 sec, 30 sec, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min 30 minuten en 1 uur worden gebruikt.

Voor het laden van hydrofobe moleculen kunnen de moleculen rechtstreeks worden toegevoegd aan een dispersie van amfifiel in oplosmiddel voorafgaand aan het coaten van de substraten.Als alternatief kan hydrofobe lading op het substraat worden afgezet vóór of na het afzetten van de amfifiel.Na het bereiden van het gecoate substraat zal hydrofobe lading direct na hydratatie in het hydrofobe gebied van de dubbellagige membranen worden verdeeld.

Om slechts één voorbeeld te geven, is de hydrofobe kleurstof Rood spaarzaam oplosbaar in water, maar is zeer oplosbaar in chloroform.Dienovereenkomstig kan Nile Red worden gemengd met een amfifiel (bijvoorbeeld een lipide) voorafgaand aan de afzetting van de amfifiel op een substraat.Bij blaasjesvorming (bijv. Na contact op te nemen met een Nijl rode/lipide-gecoate vezel met water), houdt de Nijl rood, gevangen in het membraan van de blaasjes, hecht aan de vezel maar is onoplosbaar in de groeibuffer.Dienovereenkomstig fluoresceren de vezels helder in een niet-fluorescerende achtergrond van de groeibuffer.Optioneel kunnen blaasjes vervolgens van de vezel worden losgemaakt, waarbij de Nijl rood (nog steeds gevangen in de vesicle -membranen) van de vezels in de waterige fase wordt gedragen.

Hydrofiele lading kan ook worden afgezet op het substraat voor gelijktijdige oplossing en laden in de blaasjes.De polysacharide dextran is bijvoorbeeld zeer oplosbaar in water.Een waterige oplossing van een hydrofiel molecuul (bijv. Een polysacharide zoals dextran) kan op een substraat worden afgezet en kunnen drogen.Een amfifiel kan vervolgens worden afgezet op het substraat dat het gedroogde hydrofiele molecuul bevat.Bij blaasjesvorming wordt het hydrofiele molecuul (bijv. Dextran) opgelost in de oplossing (d.w.z. de groeibuffer) en is ingekapseld in de lumen van de blaasjes.ZienFig.27.

Gecontroleerde blaasjesvorming en afgifte

Wanneer amfifiel wordt afgezet op een substraat met behulp van de hierin beschreven methoden en samenstellingen, vormt dit lamellaire stapels amfifiel.Bij contact met water of waterige oplossingen, blazen deze stapels spontaan.Voor bepaalde toepassingen is het wenselijk om vesiculatie te voorkomen of te vertragen, met behoud van het substraat in een waterige omgeving;Trigger vervolgens op een later tijdstip vesiculatie.

Dienovereenkomstig worden methoden verstrekt om vesiculatie uit te stellen en vervolgens te activeren van een met amfifiel gecoat substraat in waterige oplossing.De methoden zijn gebaseerd op het feit dat oplossingen met een hoge osmotische druk vesiculatie voorkomen.Dienovereenkomstig is een met amfifiel gecoat substraat gehydrateerd in waterige oplossingen die een opgeloste stof (osmoliet) bevatten die een osmotische druk uitoefent groter dan 1 kPa, die vesiculatie voorkomt.Een dergelijke voorwaarde kan worden bereikt door een oplossing van bijvoorbeeld 2 mm Ficoll 400 te gebruiken. Vesicle -vorming kan vervolgens worden geactiveerd door de osmoliet te verdunnen tot een concentratie die blaas mogelijk maakt;Dat resulteert bijvoorbeeld in een osmotische druk onder 1 kPa (die overeenkomt met een concentratie van 0,7 mM ficoll 400 of minder), waardoor blaasjes zich vormen.

Extra osmolieten die in deze methoden kunnen worden gebruikt, omvatten, maar zijn niet beperkt tot caseïne, runderserumalbumine (BSA), dextrans (bijv. Dextran 100.000, dextran 6.000), polyvinylpyrrolidonen (bijv., PVP 3500, pvp 800, pvp 350), pvp 350), pvp 350), pvp 350), pvp 350),en polyethyleenglycolen (bijv. PEG 3000, PEG 600, PEG 400).Voorwaarden voor remming en inductie van vesicle -vorming zullen verschillen voor verschillende osmolieten en worden getoond inFig.9.

Toepassingen van deze methode omvatten verzending amfifiel gecoate substraten in natte (osmolyt-bevattende) zakjes in een geactiveerde toestand (bijvoorbeeld om de functie van gevoelig eiwitten of geneesmiddelen te behouden) en vervolgens het gecoate substraat in een oplossing te plaatsen die zonder osmoliet om vesiculatie te triggeren.

Vesiculatie kan ook worden geregeld door temperatuur.In deze methoden zijn met amfifiel gecoate substraten gehydrateerd in waterige oplossingen onder de overgangstemperatuur van de amfifiel.Wanneer onder de overgangstemperatuur, blaas de amfifiel niet op de substraten.Een dergelijke voorwaarde kan bijvoorbeeld worden bereikt door te gebruiken als een amfifiel 1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine die een overgangstemperatuur van 35 ° C heeft bij het verhogen van de temperatuur boven 35 ° C, bijvoorbeeld door te plaatsenHet met amfifiel gecoate substraat in contact met het menselijk lichaam, dat een temperatuur van 37 ° C heeft, worden blaasjes gevormd.Met amfifiel gecoate substraten kunnen dus in een geactiveerde toestand worden verzonden en vervolgens geactiveerd vesiculatie wanneer geschikte temperatuuromstandigheden worden bereikt.

Extra amfifielen worden elders hierin beschreven en de overgangstemperaturen van amfifielen zijn bekend in de kunst.

Fabricage

De hierin beschreven methoden voor blaasjesassemblage op vezels zijn compatibel met de productie van grote aantallen blaasjes in een gecentraliseerde productiefaciliteit.Stoffen en papieren worden routinematig verwerkt met behulp van grote machines, bijvoorbeeld voor drogen, afdrukken, wassen, enz. Dienovereenkomstig zijn batchverwerkingsmethoden en assemblagelijnprocedures voor het verkrijgen van blaasjes haalbaar met behulp van de hierin beschreven methoden.Dergelijke grootschalige methoden zijn onpraktisch en/of onbetaalbaar duur met behulp van de huidige procedures voor productie-blaasjes.Het feit dat stoffen herbruikbaar zijn (zie Voorbeeld 6) is ook consistent met grootschalige productie van blaasjes met behulp van de hierin beschreven methoden.

Therapeutische composities en therapeutische toepassingen

In bepaalde uitvoeringsvormen bieden blaasjesgecoate vezels (bijv. Zijde, katoen) therapeutische samenstellingen voor gebruik als verbanden die bijvoorbeeld analgeticum, anesthetisch, antibioticum (bijv. Antimicrobieel, antischimmel) en/of antivirale verbindingen bevatten.Zowel hydrofiele als/of hydrofobe verbindingen kunnen in dergelijke samenstellingen worden opgenomen.Hydrofiele verbindingen zijn ingekapseld in de lumen van blaasjes, waar ze worden beschermd tegen de omgeving en tegen drugdeactiverende moleculen die kunnen worden vrijgegeven door bepaalde infectieuze micro-organismen, totdat afgifte wordt geactiveerd.

Afgifte kan bijvoorbeeld worden geactiveerd door het verband te nat maken met water of een waterige oplossing zoals zoutoplossing of PBS, of door contact met lichaamsvloeistoffen in de wond.Afgifte kan ook worden geactiveerd door veranderingen in de temperatuur van de wond in vergelijking met het omringende weefsel (bijvoorbeeld vanwege ontsteking en/of infectie) en/of veranderingen in pH in de wond in vergelijking met de omliggende weefsels.

Afhankelijk van de vesicle -grootte, mate van lamelariteit van de blaasjes, lipide (of amfifiel) samenstelling van blaasje, vorm van de blaasjes, diffusiecoëfficiënt van de verbinding, scheidingscoëfficiënt van de verbinding, temperatuur en de aanwezigheid of afwezigheid van stroming, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte, de afgifte.De snelheid van de verbinding (s) in een wond kan worden geregeld.Verschillende soorten targeting -moleculen (bijv. Lectines, antilichamen, nanobodieën, fab -fragmenten, eiwitreceptoren of liganden, annexine V) kunnen worden opgenomen in vesicle membranen om het blaasje naar een bepaalde cel of weefsel in een onderwerp te sturen.

De chemotherapeutische middelen doxorubicine en taxol zijn voorbeelden van hydrofobe geneesmiddelen die kunnen worden getransporteerd en geleverd door blaasjes zoals hierin beschreven.Deze verbindingen hebben moleculaire kenmerken die vergelijkbaar zijn met die van Nijlrood, zoals gefuseerde vlakke cyclische ringen, en hebben dus vergelijkbare laadkenmerken.Afgifte van deze geneesmiddelen treedt op wanneer de vesicle -membranen versmelten met het plasmamembraan van doelcellen, of wanneer de blaasjes worden opgenomen (bijvoorbeeld endocytose) door de doelcellen.

Aanvullende voorbeeldige therapeutische vrachtmoleculen omvatten virussen (die een vectoren voor genafgifte kunnen gebruiken), bacteriofagen (die kunnen worden gebruikt als antibacteriële middelen voor bijvoorbeeld behandeling van infecties door antibioticaresistente bacteriën) en zilveren nanodeeltjes (die ook kunnenworden gebruikt als antibacteriële middelen).

Aanvullende therapeutische samenstellingen omvatten stents (bijv. Voor afgifte van een anticoagulerende verbinding), zetpillen, pessaria (bijvoorbeeld voor afgifte van een anticonceptie) en sublinguale applicators.

Cosmetische composities en cosmetische toepassingen

Zoals opgemerkt, kunnen blaasjes worden gebruikt als dragers van zowel hydrofiele stoffen (in hun lumen) als/of hydrofobe stoffen (in hun membraan).In bepaalde uitvoeringsvormen worden de hierin onthulde stoffen van de blaasjes gebruikt als applicators (bijv. Huidplekken, gezichtsmaskers) voor cosmetische middelen.De menselijke huid heeft een hydrofobe barrière en er is aangetoond dat liposomale formuleringen het transport van hydraterende moleculen en andere adjuvantia in diepere huidlagen verhogen.

Dienovereenkomstig biedt de openbaarmaking in één uitvoeringsvorm voor het verstrekken van anti-verouderingscosmetica met blaasjes gecoate zijdeplaten waarbij de blaasjes een anti-verouderingsmiddel bevatten, zoals bijvoorbeeld retinol.Retinol, een hydrofobe verbinding, wordt opgenomen in blaasjesmembranen door bijvoorbeeld co-dispererende retinol met een amfifiel in een oplosmiddel, waarbij de vloeistof wordt aangebracht op een substraat zoals katoen of zijde en drogen.Aldus worden met retinol gecoate zijden gezichtsmaskers voor huidbehandeling verstrekt.Toepassing van het masker (bijv. Op het gezicht) gevolgd door bevochtiging en/of zachte opwinding van het masker zal het retinol op de huid van het onderwerp vrijgeven.

In aanvullende uitvoeringsvormen voor dermale verjonging worden door blaasjes gecoate vezels, waarin de blaasjes ceramiden in hun membranen bevatten, gebruikt.Veel huidlipiden zijn samengesteld uit hoogsmelten temperatuurceramiden die vast zijn bij kamertemperatuur en daarom moeilijk te transporteren in de huid.Het verspreiden van dergelijke ceramiden in het blaasje membraan zal de opname van de ceramide (s) in de huid vergemakkelijken.

Substraten kunnen worden gecoat met amfifielen door amfifiel op te lossen in een geschikt oplosmiddel of mengsels van oplosmiddelen (bijvoorbeeld methanol, korrelalcohol, aceton, water en/of mengsels daarvan) en vervolgens de amfifiel toe te passen op een stof of ander substraat door gebruikEen aerosolizer, vernevelaar of spuitfles.

Dienovereenkomstig omvatten extra composities met blaasjes gecoate stoffen (bijv. Performance-stoffen voor gebruik in sport en oefening) die anti-spiranten en/of geuren bevatten.In deze uitvoeringsvormen wordt een cosmetisch molecuul (bijvoorbeeld een anti -transpirant en/of een geur) in blaasjes geladen, zoals hierin beschreven, en de geladen blaasjes worden geformuleerd als een spray of aerosol die vervolgens op een stof kan worden toegepast (Artikel van kleding gemaakt van een natuurlijk voorkomende of synthetische stof zoals hierin bekendgemaakt).In deze uitvoeringsvormen dient het kledingstuk dus als het substraat en anti-transpirant bevattende en/of geurbevattende blaasjes worden gevormd op het kledingstuk.Bij bevochtiging van de stof, hetzij door transpiratie of met water of een waterige oplossing, worden de vrachtmoleculen (bijvoorbeeld anti -transpirant, geur) vrijgelaten uit de kleding.

Andere verbindingen zoals bijvoorbeeld zonnebrandmiddelen, insectenweergaven, antibacteriële verbindingen (om bacteriële geuren te regelen), bevochtigingsmiddelen (voor huidhydratatie), nicotine en prestatiebevorderende medicijnen kunnen ook worden opgenomen in kleding op vergelijkbare wijze.

In aanvullende uitvoeringsvormen kan een spray of aerosol waarin de blaasjes een geur bevatten en/of een anti -transpirant op de huid van een onderwerp worden gespoten waarbij, bij transpiratie, blaasjes worden vrijgegeven en de geur en/of anti -transpirant worden afgeleverd.

Aanvullende toepassingen

Cellulose en nanocellulose kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid aan biomedische en farmaceutische gebieden, zoals bijvoorbeeld medicijnafgifte, weefseltechniek, wondgenezing, contactlenzen, kunstmatige bloedvaten, hemodialyse en productie van farmaceutische producten op basis van eiwitten;Vanwege hun niet -toxiciteit, biologische afbreekbaarheid, structurele sterkte en thermische stabiliteit.De mogelijkheid om blaasjes op deze cellulose- en nanocellulosische materialen te storten, zal hun nut in deze gebieden verder uitbreiden.Cellulosische bandages kunnen bijvoorbeeld worden geladen met blaasjes die analgetische, anesthetische en/of antibiotische verbindingen bevatten.Stents of andere intravasculaire inzetstukken kunnen worden bekleed met blaasjes die anticoagulantia, statines of andere cholesterolverlagende middelen en/of bloeddrukmedicatie bevatten.De bloedstroom veroorzaakt een vloeistofschuifspanning die de blaasjes van de stents naar stolsels of andere beperkingen kan transporteren.Materialen die worden gebruikt in weefseltechniek kunnen worden bekleed met blaasjes die bijvoorbeeld groeifactoren, groeiremmers en/of ATP bevatten.Omdat blaasjes vergelijkbare afmetingen zijn als cellen, kunnen blaasjes bovendien dienen als een nabootsing van cellen om contactstimulus of steigers te bieden.

Blaasjes zoals hierin worden bekendgemaakt, zijn zelf-geassembleerde macromoleculaire structuren die nuttig zijn voor het inkapselen en regelen van de afgifte van lading, synthetiserende eiwitten (bijvoorbeeld door celvrije synthese) en anorganische mineralen (bijv. Door biomineralisatie), constructerende kunstmatige cellen (b.v. Red Blood Cellen (bijv., het bouwen van nanocondites, nanodraden en nanodeeltjes door bio -geïnspireerde sjabloonstrategieën en het ophelderen van de oorsprong van het leven door de constructie van minimale protocellen.

Voorbeelden Voorbeeld 1: Groei van blaasjes op cellulose met behulp van fosfolipiden

Een aantal verschillende fosfolipide amfifielen, zoals weergegeven in tabel 1, werden gebruikt om blaasjes op cellulosepapier te assembleren.Hiertoe werd 10 ul van een oplossing van 1 mg/ml van de amfifiel in chloroform afgezet op een stuk papier met diameter van 9,5 mm.Het oplosmiddel mocht verdampen en vervolgens werd het papier gedurende 1 uur onder vacuüm uitgedroogd om sporen van residueel oplosmiddel te verwijderen.Het met lipide gecoate papier werd vervolgens bij kamertemperatuur in een waterige "groeibuffer" geplaatst.De keuze van de groeibuffer werd bepaald door het doel van het experiment.Om bijvoorbeeld blaasjes met een hogere dichtheid te verkrijgen dan de omliggende oplossing, werden de blaasjes gekweekt in een oplossing van 100 mm sucrose.Andere buffers die kunnen worden gebruikt, zijn veelgebruikte ionische buffers zoals TBS (Tris Buffered Souline), HEPES 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanenulfonzuur of PBS (fosfaatbufferde zoutoplossing).Blaasjes werden losgemaakt van de vezel door vloeistofafschuifstroom toe te passen, bijvoorbeeld door een pipet te gebruiken om te aspireren loodrecht op het oppervlak van het papier.De blaasjes kunnen worden vrijgegeven in dezelfde buffer waarin ze worden geteeld;of kan worden vrijgegeven in een andere buffer.Om bijvoorbeeld blaasjes met een hogere dichtheid te produceren dan de omliggende oplossing, werden de blaasjes vrijgegeven in een oplossing van 100 mM glucose of ficoll.

Voor blaasjes bereid uit het verzadigde lipide 1,2-dipalmitoyl-Sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC) en het lipidenmengsel ESM: DOPC: CHOL: Topfluor-cholesterol: Rhodamine-DPPE, de temperatuur van de groeibuffer was 65 °C., en groei werd 90 minuten uitgevoerd.

Voorbeeld 2: Groei van oliezuurblaasjes op cellulose

Oliezuur heeft de structuur ch₃(Ch₂))₇Ch═ch— (ch₂))₇—Cooh en een molecuulgewicht van 282.46.Fig.1.Oleïschzuur is een relatief eenvoudige amfifiel, bestaande uit een enkele hydrofobe alkylketen van 18 koolstofatomen (met een onverzadigde binding bij C9) en een hydrofiele carbonzuurkopgroep.Amfifielen met enkele alkylketens vormen typisch micellen, (dit zijn compacte lipide-aggregaten, ongeveer 80-100 nm in diameter, die geen waterig lumen hebben ingesloten door de lipiden) omdat hun moleculaire geometrieën leiden tot pakkingparameters die minder dan één zijn (minder dan één (die niet de vorming van lamellaire fasen en blaasjes bevordert).Daarom kunnen micellen geen hydrofiele lading omsluiten.Blaasjes daarentegen omsluiten een waterig hydrofiel lumen en hun diameters kunnen in grootte variëren van honderden nanometer tot honderden micrometers.Dienovereenkomstig was het interessant om te bepalen of een enkele alky keten amfifiel, zoals oliezuur, kon worden geïnduceerd om blaasjes te vormen.

Als een substraat werd een stuk van Whatman Grade 42 -filterpapier in een ruwe cirkel gesneden met een diameter van ongeveer 15 mm.Oliezuur werd in chloroform verspreid naar nominale oppervlakteconcentraties van 0,3, 3,0 en 6,0 nmol/mm²(uitgaande van een diameter van 12 mm), samen met 0,5 mol % Nijl rood om te dienen als een fluorescerende indicator voor membranen.Tien ul van elke oliezuuroplossing werd afgezet in het midden van een filterpapiercirkel en het papier werd 60 minuten in een vacuümkamer geplaatst.Het gedroogde papier werd vervolgens aangebracht op een kamer, die werd ingebracht in een putbevatie met 1 ml groeibuffer (0,2 m bicine/0,25 m sucrose/1 mm natriumoleaat, pH 8,5) zodat het amfifiel gecoate gebied van het papier wasvolledig ondergedompeld in de groeibuffer.Met oliezuur gecoat papier werd 90 minuten geïncubeerd in groeibuffer, waarna de kamer uit de groeibuffer werd verwijderd, in een lege putje geplaatst en 0,6 ml extractiebuffer (0,2 m bicine/0,25 m glucose/1 mm natriumoleate,pH 8.5) werd door het papier gegoten.Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

Analyse van het cellulosepapier na coating met oliezuur bij nominale oppervlakteconcentraties van 0,3, 3,0 en 6,0 nmol/mm²en incubatie in groeibuffer gedurende 90 minuten werd uitgevoerd door confocale laserscanmicroscopie van het gecoate papier na excitatie van Nile -rode fluorescentie met een 561 nm diode lasercellulosepapier dat was gecoat met 0,3 nmol/mm²Oleïschzuur leek geen blaasjes op het papier te laten groeien.Na coating met oliezuur bij een nominale oppervlakteconcentratie van 3,0 nmol/mm², Talrijke vetzuurblaasjes werden waargenomen groeiend op het papier.Naast blaasjes werden ook vetzuurdruppeltjes en multivesiculaire structuren waargenomen.Coating van het papier met een nominale oppervlakteconcentratie van 6,0 nmol oliezuur/mm²resulteerde in de vorming van een groot aantal zeer fluorescerende vetzuurdruppeltjes en multi-vesiculaire structuren.

Monsters werden uit het papier geëxtraheerd door een gebufferde glucoseoplossing over het papier te pipetteren, om vloeistofschaar te veroorzaken en de monsters werden waargenomen door confocale microscopie.Monsters geëxtraheerd uit papier dat was bekleed met een nominale oppervlakte -concentratie van 3,0 nmol oliezuur/mm²bevatten veel bolvormige blaasjes met dunne, uniform-fluorescerende membranen, die de blaasjes onderscheiden van druppeltjes, aggregaten en andere structuren.Monsters geëxtraheerd uit papier dat was bekleed met een nominale oppervlakte -concentratie van 6,0 nmol oliezuur/mm²en hoger werden gedomineerd door vetzuurdruppeltjes.Deze resultaten geven aan dat de concentratie van het vetzuuroppervlak belangrijk is voor het verkrijgen van relatief homogene populaties van vetzuurblaasjes uit cellulosevezels.Nominale oppervlakteconcentraties van 1-3 nmol/mm²Geproduceerde optimale resultaten, die grote aantallen homogene blaasjes opleveren.

Verdere karakterisering van de populatie van blaasjes verkregen uit cellulosepapier gecoat met een nominale oppervlakteconcentratie van 3 nmol/mm²oliezuur gaf aan dat, tussen blaasjes met een diameter groter dan 5 urn (de ondergrens waarbij blaasjes konden worden onderscheiden van andere structuren), 70% een diameter had tussen 5-10 μm en ongeveer 20% had een diameter tussen 10-15 μm.Bovendien werden multilamellaire (bi- en trilamellaire) blaasjes met concentrische membranen waargenomen.Analyse van fluorescentie -intensiteiten in de blaasjes gaf aan dat vesicle -monsters bestonden uit ongeveer 66% unilamellaire blaasjes, 24% bilamellaire blaasjes en 9% trilamellaire blaasjes;met een zeer klein percentage van het monster dat blaasjes bevat met meer dan drie concentrische membranen.

Voorbeeld 3: Groei van blaasjes op cellulose met behulp van diblock -copolymeren

De Diblock Copolymers Poly (butadieen-B-ethyleenoxide) (PBD_MPeo_N) zijn een familie van synthetische longketen polymere amfifielen met een hydrofobe polybutadieenblok covalent gebonden aan een hydrofiel poly (ethyleenoxide) blok.Met geschikte waarden van M en N, de pakkingparameter van PBD_MPeo_Nkan worden aangepast om de vorming van blaasjes te bevorderen, bekend als polymersomen.Diblock -polymeren, vanwege hun grote moleculaire aantallen (m_Ns), vorm tweelaagmembranen met een grotere dikte dan dubbellaagmembranen gevormd uit fosfolipiden.De hoge mate van ketenverstrengeling van PBD -blokken resulteert in de vorming van mechanisch robuuste membranen, met permeabiliteiten die lager zijn dan de permeabiliteiten van membranen gevormd uit fosfolipiden.

PBD₄₆Peo₃₀(M_N˜3900,Fig.2) werd opgelost in chloroform, samen met 0,5 mol % Nijl rood bij nominale oppervlakte -concentraties van 0,02, 0,2 en 2,0 nmol/mm².Groei en extractie van blaasjes werden uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld 2, behalve dat de groeibuffer 0,25 m sucrose was en groei werd uitgevoerd bij 80 ° C.

Analyse van het cellulosepapier na coating met PBD₄₆Peo₃₀bij nominale oppervlakte -concentraties van 0,02, 0,2 en 2,0 nmol/mm²en incubatie in groeibuffer gedurende 90 minuten bij 80 ° C. werd uitgevoerd door confocale laserscanmicroscopie van het gecoate papier na excitatie van Nile -rode fluorescentie met een 561 nm diodelaser.Cellulosepapier dat was bekleed met 0,02 nmol/mm²PBD₄₆Peo₃₀bevatte alleen onvervonden polymeer bevestigd aan de vezels, maar geen polymersomen.Papier bedekt met PBD₄₆Peo₃₀bij een nominale oppervlakteconcentratie van 0,2 nmol/mm²bevatten talloze blaasjes (polymersomen) met minimale resterende polymeer die zich aan de cellulosevezels hecht.Papier bedekt met PBD₄₆Peo₃₀bij een nominale oppervlakteconcentratie van 2,0 nmol/mm²Bevat, samen met polymersomen, grote aggregaten van de polymeercoating van de vezels.Een nominale oppervlakteconcentratie tussen 0,1-0,6 nmol/mm²bleek optimaal te zijn voor het vormen van polymersomen met PBD₄₆Peo₃₀.

Polymersomen werden geëxtraheerd uit PBD₄₆Peo₃₀-Coated cellulose met behulp van dezelfde extractiemethode beschreven in voorbeeld 2 en waargenomen door confocale microscopie.De grootteverdeling van polymersomen geëxtraheerd uit PBD₄₆Peo₃₀-coated cellulose bleef smal (mediane 9 urn diameter) over een bereik van PBD₄₆Peo₃₀concentraties van 0,1-2,0 nmol/mm².Analyse van de gemiddelde fluorescentie -intensiteit van de membranen van polymersomen die waren geëxtraheerd uit cellulose gecoat met een nominale oppervlakteconcentratie van 0,2 nmol/mm²PBD₄₆Peo₃₀gaf aan dat ongeveer 96% van de polymersomen unilamellair waren en ongeveer 4% bilamellair was.Fluorescentielekkage-testen, met behulp van het porievormende eiwit a-hemolysine was consistent met een populatie die een meerderheid van unilamellaire polymersomen bevatte.Polymersomen bereid met behulp van nominale oppervlakteconcentraties van PBD₄₆Peo₃₀tussen 0,1 en 0,6 nmol/mm²leverde vergelijkbare resultaten op.

PBD₄₆Peo₃₀Polymersomen kunnen ook worden geproduceerd bij lagere temperaturen, maar de groei is langzamer.Incubatie van PBD₄₆Peo₃₀-Coated cellulosepapier in 0,25 M sucrose groeibuffer gedurende 12 uur bij kamertemperatuur geproduceerde resultaten vergelijkbaar die verkregen uit een incubatie van 90 minuten bij 80 ° C.

Voorbeeld 4: Tijdelijk ontkoppelde lading van polymersomen met eiwitten

De vereiste voor hoge temperatuur voor een snelle groei van PBD₄₆Peo₃₀Polymersomen lijken het gebruik van PBD uit te sluiten₄₆Peo₃₀Polymersomen voor het inkapselen van temperatuur-labiele vrachtmoleculen zoals eiwitten en andere biologische moleculen.In dit voorbeeld is een methode waarbij hoge temperatuurgroei van PBD₄₆Peo₃₀Polymersomen is tijdelijk ontkoppeld door inkapseling van vracht door PBD₄₆Peo₃₀Polymersomes wordt beschreven.In het kort werden polymersomen snel gegroeid bij hoge temperatuur, wat leidde tot afzetting, op de cellulose, van polymersomen met niet -afgesloten membranen.Koeling liet de membranen niet ontsloten, zolang de polymersomen aan de cellulose bleven.Het niet-afgesloten membraan maakt het mogelijk dat membraan-impermeabele moleculen en geladen moleculen diffunderen in het lumen van het polymersoom langs een concentratiegradiënt.Extractie van de polymersomen uit de cellulose in bulkoplosmiddel verzegelt de membranen en valt het vrachtmolecuul in het lumen vast.

PBD₄₆Peo₃₀Polymersomen werden gekweekt en gelabeld met Nile Red (in een microtiter put) zoals beschreven in Voorbeeld 2 behalve dat de vesicle -groei werd uitgevoerd in 0,25 m sucrose gedurende 60 minuten bij 80 ° C met behulp van Whatman graad 42 filterpapier gecoat met een nominale oppervlakconcentratie van0,2 nmol/mm²PBD₄₆Peo₃₀.De monsters werden vervolgens gekoeld tot kamertemperatuur en 20 x PBS werd toegevoegd om de ionsterkte in fysiologische omstandigheden te brengen (1 x PBS).De gecoate cellulose werd vervolgens uit de put verwijderd en 40 ul fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) -conjugated runderserumalbumine (BSA) (2,5 mg/ml in PBS) werd aan de put toegevoegd en gemengd om een ​​eindconcentratie van 1,5 μm te verkrijgenFITC-BSA.De diffusieconstante, d, van BSA is ongeveer 6 × 10⁻¹¹M²/sec.Dus voor polymersomen met een diameter, x, van 10 μm, is de karakteristieke tijd voor diffusie, t, x²/D, of ongeveer 2 sec.De gecoate cellulose werd vervolgens teruggestuurd naar de put en gedurende een uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, wat voldoende tijd voor diffusie opleverde;waarna een ml van 0,25 m glucose in 1 x PBS werd gebruikt om de polymersomen uit de cellulose te extraheren.De polymersoom bevattende suspensie werd 20 minuten onderworpen aan centrifugatie bij 5000 tpm in een 2-ml microcentrifugebuis.De onderste 100 ul werd verwijderd, geresuspendeerd in 0,9 ml verse glucose/PBS en opnieuw gecentrifugeerd bij 5000 rpm gedurende 20 minuten in een 2 ml microcentrifugebuis.De centrifugatie/resuspensiecyclus werd nog twee keer herhaald en na de uiteindelijke centrifugatie werd de onderste 40 ul verwijderd en overgebracht naar een beeldvormingskamer bestaanplakband.

Polymersoombelasting werd gekwantificeerd door confocale microscopie, met behulp van Nile -rode fluorescentie om de grenzen van polymersomen en FITC -fluorescentie te lokaliseren om het BSA -vrachteiwit te identificeren.FITC -fluorescentie werd geëxciteerd met de 488 nm laserlijn van een argonlaser en de gemiddelde intensiteit van FITC -fluorescentie, binnen polymersoomgrenzen, werd bepaald.De meeste polymersomen verkregen door het in dit voorbeeld beschreven proces bevatten sterke FITC -fluorescentie in hun lumen, wat een succesvolle inkapseling van BSA aantoont.Kwantitatieve analyses toonden aan dat slechts ongeveer 20% van de polymersomen FITC -intensiteiten had binnen de laagste 10% van de fluorescentie -intensiteitsverdeling.

Deze resultaten laten zien dat een eenvoudig, diffusie-gecontroleerd bench-top proces, met behulp van een enkele microtiter put in een plaat van 24 putjes, ongeveer 2 x 10 opleverde⁴Laadde polymersomen binnen ongeveer twee uur.Het proces kan worden opgeschaald door parallellisatie of door het verhogen van het gebied van de cellulose en de concentraties en volumes van de coatingmaterialen en lading.

Voorbeeld 5: Groei van blaasjes op cellulose met behulp van triblokcopolymeren

De commerciële ABA TriBlock-copolymeer polyoxyethyleen-polyoxypropyleen-polyoxyethyleen (PEO₅PPO₆₇Peo₅, Handelsnaam Pluronic® L121, M_N˜4400,Fig.3) vormt grote polymersomen onder beperkte omstandigheden.Het is moeilijk gebleken om grote polymersomen uit dit polymeer te produceren vanwege de lage mate van hydrofobiciteit.Do Nascimento et al.(2016)Langmuir32: 5350-5355;Rodriguez-Garcia et al.(2011)Zachte materie7: 1532.

Om triblock-copolymeer-bevattende blaasjes te produceren, Pluronic® L121 (m_N˜4400,Fig.3) werd opgelost in chloroform, samen met 0,5 mol % Nijl rood, bij nominale oppervlakteconcentraties van 0,6 en 2,0 nmol/mm².Groei en extractie van blaasjes werden uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld 2, behalve dat de groeibuffer 0,025 m Ficoll 400 was (een sucrose -polymeer met MW˜400.000).

De grootteverdeling van geëxtraheerd polymersomen (dezelfde extractiemethode als beschreven in Voorbeeld 2) uit cellulose gecoat met Pluronic® L121 bij een nominale oppervlakteconcentratie van 0,6 nmol/mm²werd onderzocht door confocale fluorescentiemicroscopie na excitatie van rode fluorescentie in de Nijl.Onder de duidelijk geïdentificeerde polymersoomstructuren met een diameter groter dan 5 urn, had 95% een diameter tussen 5-10 urn en ongeveer 4% was tussen 10-15 urn in diameter.Analyse van de gemiddelde fluorescentie -intensiteit van de membranen gaf aan dat de polymersomen overwegend unilamellair waren.

Polymersomen gemaakt van Pluronic® L121 gevormd optimaal op cellulose bij een nominale oppervlakteconcentratie tussen 0,6 en 1 nmol/mm²op kamertemperatuur.

Voorbeeld 6: Vorming van blaasjes op cellulosevezels

Eerdere voorbeelden hebben de vorming en groei van blaasjes op cellulosepapier beschreven.In dit voorbeeld werden blaasjes geassembleerd op een andere vorm van cellulose, namelijk katoen;en eigenschappen van blaasjes op papier en katoen werden vergeleken.Zowel filterpapier als katoenen stof worden vervaardigd uit cellulosevezels die worden verkregen uit bollen die zich rond de zaden van de katoenplant vormen (Gossypiumsp.)³⁹.Cellulosevezels van katoenbollen zijn de hoogste zuiverheid natuurlijke bron van a-cellulose³⁹, en is een grondstofschaal hernieuwbaar grondstof⁴⁰.Filterpapier met hoge zuiverheid bestaan ​​uit cellulosevezels van ongeveer 1,5 mm-6 mm lang verkregen uit de korte vezels bevestigd aan het katoenzaad (katoenen linters).Deze korte vezels verstrikken tijdens het papierproductieproces om een ​​ongeordend willekeurig gepercoleerd netwerk te vormen⁴¹.

Katoenen stof, ook samengesteld uit cellulosevezels, heeft een radicaal andere microstructuur dan papier.De cellulosevezels die worden gebruikt om katoenen stof te maken, worden verkregen uit de basisvezels van de katoenen bol³⁹.Deze vezels hebben lengtes van 20 mm of langer en kunnen lengtes tot 40 mm bereiken³⁹.Honderden van deze lange cellulosevezels worden gesponnen in strak gedraaide bundels om garen te vormen³⁹.Het garen wordt vervolgens geweven om een ​​geïnterlineerd netwerk te vormen³⁹.Afhankelijk van het weefpatroon laat het proces regelmatige vensters van lage tot geen cellulose -gehalte tussen de orthogonale bundels garen achter.Aldus worden de cellulosevezels in stof sterk geordend in plaats van willekeurig verstrikt, zoals die in papier.

Materialen

WhatMan® Grade 41 Filtratierepapier, Whatman® Grade 1 Filtratiedocument, Whatman® As -onuitgave 42 Filtratiedocum, Glass Microscope Dia's (Thermo Scientific ™) en glazen deksels (nr. 1 dikte, Thermo Scientific ™) werden verkregen van Thermo Fisher Scientific Wetenschappelijk(Waltham, Mass.).Ongebleekte katoenen stof bestaande uit 100% biologisch katoen werd verkregen van Amazon Inc. (Organic Cotton Plus (Lubbock, Tex.)).

Chemicaliën

Sucrose (bioxtra-graad, zuiverheid ≥99,5%), glucose (bioxtra-graad, zuiverheid ≥99,5%) en caseïne uit rundermelk (bioreagent grade) werden verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.).Chloroform, met 0,75% ethanol als conserveermiddel, (ACS -graad, zuiverheid ≥99,8%) werd verkregen van Thermo Fisher Scientific.Ultrapure water (18,2 MΩ) werd verkregen met behulp van een Elga Pure-Lab Ultra Water Purification System (Woodridge, Ill.).1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (18: 1 (Δ9-cis) pc (DOPC)) en 1-palmitoyl-2- (dipyrrometheneboron difluoride) undecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (topfluor®-Pc) werden verkregen van Avanti Polar Lipiden, Inc. (Alabaster, Ala.).

Voorbereiding van substraten

Katoenweefsel, commercieel verkregen zoals hierboven beschreven, werd gereinigd met de niet-polaire oplosmiddelchloroform en het polaire oplosmiddel ultrazuinig water om niet-polaire en polaire onzuiverheden te verwijderen, die mogelijk aan de stof zijn bevestigd tijdens de productieprocessen en transport.Een stuk katoenen stof van 10 cm x 10 cm werd gedurende 30 minuten gedrenkt in 50 ml nette chloroform.Na 30 minuten werd de chloroform weggegooid en herhaalde het proces.De chloroform mocht verdampen en vervolgens werd de stof afwisselend gespoeld en in een teveel aan ultrazoegwater gedrenkt in de loop van 3 uur.Na de laatste spoeling werd de stof gedroogd bij omgevingstemperatuur.

Filterpapier van laboratoriumkwaliteit is gecertificeerd door de fabrikant om vrij te zijn van onzuiverheden.Desalniettemin werd voor consistentie met de behandeling van het weefsel 30 minuten in chloroform gedrenkt;waarna de chloroform werd weggegooid en het proces herhaalde.De chloroform mocht verdampen en het papier werd vervolgens 30 minuten in water geweekt.Vanwege de lage natte sterkte van het papier, werd het slechts 30 minuten in water gedrenkt zonder agitatie, vergeleken met de drie uur durende weken waaraan de katoenen stof werd onderworpen.Het papier werd vervolgens gedroogd bij omgevingstemperatuur.Om substraten van consequent grootte te verkrijgen, werden cirkelvormige schijven met een diameter van 9,5 mm uit de papieren geponst met een papieren punch (EK Tools Circle Punch, ⅜-inch).Vergelijkbare stukken stof werden gesneden met een schaar.

Groei van GUV's

Een 99,5: 0,5 mol % oplossing van DOPC: topfluor-PC werd bereid in nette chloroform bij een concentratie van 2 mg/ml.Groeiomstandigheden werden gestandaardiseerd door geschikte volumes van de lipide -oplossing af te zetten om 3 μg lipide per 1 mg cellulose te verkrijgen (lipide/cellulose molratio˜7 × 10⁴) op de substraten.Het kleine volume oplosmiddel (10-20 μl) verdampte snel.De met lipide gecoate substraten werden vervolgens gedurende een uur in een standaard vacuümstismator geplaatst om sporen van oplosmiddel te verwijderen.To grow GUVs, the dry lipid-coated substrates were placed into a 2-mL microcentrifuge tube (e.g., Eppendorf), to which was then added 500 μL of an aqueous solution of sucrose at a concentration of 100 mM, and the tubes were incubatedgedurende 60 minuten.

Cover Slip-ondersteund oogsten van GUV's

Een druppel van 100 ul van een waterige oplossing van 100 mm van sucrose werd op een glazen dekglaasje geplaatst.Lipide-gecoate substraat, bereid zoals beschreven in de vorige paragraaf, werd overgebracht in de druppel met behulp van een tang.Water bleef gevangen in de hydrofiele poreuze cellulose -substraten tijdens de overdracht, waardoor de GUV's bewaren.GUV's werden geoogst door de oplossing voorzichtig te aspireren met een gesneden pipetpunt, waardoor het oppervlak van het substraat wordt aangeraakt.Suspensies van geoogste GUV's, in aliquots van 100 ul, werden tot gebruik overgebracht naar een schone microcentrifugebuis voor opslag.Hoge en consistente opbrengsten van GUV's werden verkregen in de vorm van geconcentreerde suspensies, die indien nodig kunnen worden verdund.Deze oogstmethode verschilt van de eerder beschreven methode met een door zwaartekracht geïnduceerde stroom van 1 ml buffer door filterpapier dat wordt ondersteund op polystyreen putvesters in platen met 24 putjes.Kresse et al.(2016)Appl.Mater.Interfaces8: 32102-32107.

Confocale microscopie en beeldanalyse van GUV's

Beeldvormingskamers werden geconstrueerd door covalent op maat gemaakte PDMS-pakkingen te binden met een vierkante opening (breedte x lengte x hoogte = 5 x 5 × 1 mm) aan glazen microscoopglaasjes.Voor gebruik werd een kamer gepassiveerd met een oplossing van 1 mg/ml caseïne om breuk van de GUV's op het kale glas te voorkomen.Faysal et al.(2017) PLOS ONE 12: nr.E0169487.De gepassiveerde kamer werd gevuld met 25 ul van een isomolaire oplossing van glucose, vervolgens werd een hoeveelheid van 5 ul van de suspensie van geoogste GUV's toegevoegd.GUV's mochten 3 uur sediment voor de beeldvorming.Beelden werden vastgelegd met behulp van een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop (LSM 880, Axio Imager.Z2M, Zeiss, Duitsland).De Topfluor®-kleurstof (Avanti, Alabaster, Ala.) Werd opgewonden met een argonlaser van 488 nm en fluorescentie werd verzameld met behulp van een 10 x plan-neofluar doelstelling met een numeriek diafragma van 0,3.Het gehele gebied van de kamer werd afgebeeld met behulp van een geautomatiseerde tegelscanroutine (49 afbeeldingen [850,19 μm × 850,19 μm, (2140 pixels x 2140 pixels)] met een dikte van de confocale plak van 13 μm).De routine gebruikte een autofocusfunctie die zich richtte op het vlak van de glazen schuif door het vlak te lokaliseren dat maximaal laserlicht weerspiegelde.Confocale afbeeldingen werden geanalyseerd met behulp van een aangepaste MATLAB -routine (MathWorks Inc., Natick, Mass.).De routine dremuleerde de beelden en paste vervolgens een stroomgebied -algoritme toe om de fluorescerende GUV's van de achtergrond te segmenteren.De native RegionProps -functie werd gebruikt om de equivalente diameters van de gesegmenteerde objecten te verkrijgen.

Scanning -elektronenmicroscopie (SEM) van de droge substraten en confocale microscopie -beeldvorming van de gehydrateerde substraten

SEM -afbeeldingen van de droge cellulose -substraten werden verkregen met behulp van een veldemissiescanning -elektronenmicroscoop (Geminisem 500, Zeiss, Duitsland).De bundelversnellingsspanning was 1 kV en secundaire elektronen werden verzameld van het oppervlak van de substraten met behulp van een Everhart-Thornley secundaire elektronendetector.Beelden werden vastgelegd met een laterale pixelresolutie van 1,09 uM/pixel [1120 uM x 840 μm (1024 × 768)].Voor beeldvorming van de gehydrateerde substraten werden de cellulosevezels fluorescerend gemaakt met de cellulosekleurstof direct rood 23 25 en confocale z-stacks werden verkregen bij een laterale pixelresolutie van 0,4 μm/pixel [640,17 μm x 640,17 μm (1620 pixels × 1620 pixels)] en een axiale afstand van 35 μm/plak.Bandpass-gefilterde maximale intensiteitsprojecties van de Z-stacks werden verkregen en de diameters van de vezels werden gemeten, met behulp van ImageJ (NIH, Bethesda, Md.).

GUV -experimenten met de groeicyclus op katoenen stof

Na het oogsten van GUV's bij de voltooiing van een groeicyclus, werd stof schoongemaakt vóór de volgende groeicyclus.Voor het reinigen na een groeicyclus van de blaasjes werd stof gespoeld met 10 ml ultrazuiver water en vervolgens gedurende 30 minuten in ultrazeksel water onder agitatie geweekt om sporen van opgeloste zouten en suikers uit de groeibuffer te verwijderen.De stof werd vervolgens 1 uur in een oven van 65 ° C geplaatst om te drogen.De droge stof werd gedurende 30 minuten gedrenkt in nette chloroform onder agitatie.De stof werd uit de chloroform verwijderd en de resterende chloroform was toegestaan ​​te verdampen, waarna de stof 1 uur in een vacuümkamer werd geplaatst om alle sporen van chloroform te verwijderen.Vers lipide werd vervolgens afgezet op de stof (zoals beschreven in het gedeelte van dit voorbeeld getiteld "Groei van Guvs" hierboven) om de volgende groeicyclus te starten.

Eigenschappen van de cellulose -substraten

Toen de papieren werden gevisualiseerd door scanning elektronenmicroscopie (SEM), verschenen de cellulosevezels in de kranten als gedraaide afgeplatte cilinders met diameters van ongeveer 15-21 μm.G41 -papier had grote poriën tussen de vezels;terwijl de schijnbare poriën kleiner en minder in aantal waren in afbeeldingen van de G1- en G42 -papers.Deze microstructurele verschillen waren consistent met de gerapporteerde deeltjesretentiecapaciteiten en stroomsnelheden van de filterpapier.SEM -afbeeldingen van de katoenen stof vertoonden een sterk geordend netwerk van gedraaide cellulosevezels in het garen met gebieden zonder cellulosevezels tussen de orthogonale strengen garen.

Omdat de groei van GUV's in water optreedt, werden de gehydrateerde substraten gekenmerkt met behulp van confocale microscopie.Maximale intensiteitsprojecties van de driedimensionale confocale Z-stacks van de substraten werden verkregen en een banddoorlaatfilter werd op de afbeeldingen toegepast om de randen van de vezels te markeren.Met behulp van deze methoden, de gemiddelde diameter van de vezels, D_F, werd bepaald als 21 ± 5 μm voor G41, 20 ± 6 μm voor G1, 16 ± 7 μm voor G42 en 16 ± 4 uM voor katoenstof.Aldus hebben G41- en G1 -papier gemiddeld grotere diametervezels, terwijl G42 -papier en de katoenen stof cellulosevezels met een kleinere diameter hebben.

De maten van de GUV's worden begrensd door de gemiddelde diameter van de cellulosevezels

Confocale beelden van de GUV's geoogst uit de vier verschillende substraten werden verkregen.Kwalitatief leken de GUV's vergelijkbaar.

De diameters van de GUV's geassembleerd op katoenen stof werden gekwantificeerd met behulp van een aangepaste MATLAB -beeldanalyseroutine.Een histogram van de diameters onthulde dat de verdeling van GUV-diameters scheef was, met een enkele goed gedefinieerde piek en rechterstaart (Fig.4).In dit histogram zijn n = 131,296 en de bin -breedtes 1 μm.De inzet toont een ingezoomde weergave van een deel van de rechterstaart.Scheve verdeling van blaasjesgroottes verkregen door een andere techniek, zachte hydratatie van lamellaire fosfolipide -stapels op glas, is eerder waargenomen¹³.Histogrammen van GUV -maten verkregen door elektroformatie^44-47en gelondersteunde hydratatie^21,23,24,48onthul ook een rechtstaartverdeling.Zonder te willen gebonden zijn aan theorie, is het mogelijk dat scheve verdeling van maten een intrinsieke eigenschap is van GUV's die worden geproduceerd door methoden die afhankelijk zijn van de vesiculatie van lamellaire fosfolipide-stacks (d.w.z. elektroformatie, gel-assisted hydratatie en cellulose-geschikte hydratatie).In tegenstelling tot een normale verdeling, die symmetrisch is, valt de gemiddelde, mediaan en modus van een scheve verdeling niet samen.Aldus weerspiegelt GUV -maten met rekenmomenten, zoals het gemiddelde en de standaarddeviatie, zonder verdere kwalificatie, waarschijnlijk niet nauwkeurig de werkelijke statistische verdeling van de bevolking.

Grootteverdelingen van GUV's geassembleerd op de verschillende substraten werden weergegeven als een doos en snorhaarplot om de verschillende populaties te vergelijken (Fig.5).De drie verschillende vakken getoond voor elk substraat vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd voor elk substraat.De lagere snorhaar geeft de minimale grootte aan (1 μm om alleen GUV's op te nemen en niet andere structuren zoals kleinere blaasjes en lipide nanobuisjes).De onderste helft van de doos vertegenwoordigt de 25^epercentiel van de verdeling.De lijn die elke doos oversteekt, geeft de mediaan van de verdeling aan.De bovenste helft van de doos is de 75^epercentiel van de verdeling.De bovenste snorhaar geeft de 98 aan^epercentiel van de GUV's.De stippellijnen boven de bovenste snorhaar vertegenwoordigen de resterende 2% van de GUV's.

De resultaten van deze analyses geven aan dat variatie in het monster-monster in GUV-maten minimaal was en de verdeling van GUV-maten opmerkelijk vergelijkbaar was tussen de drie graden papier en de katoenen stof.De mediane diameter van de GUV's was tussen de 5 en 6 μm voor alle vier de substraten, met een modus van 4 urn.Vijftig procent van de GUV's had diameters tussen 4 en 9 μm.Uit deze resultaten kan worden geconcludeerd dat de microstructuur van de cellulose -substraten, die aanzienlijk varieerde, de grootte van de GUV's niet beheerst.

Als onderdeel van deze analyse de vezeldiameter, D_F, van het substraat werd uitgezet als een stippellijn die de bovenste snorhaar in de doosplot overschreed (Fig.5).Het is duidelijk dat 98% van de GUV's diameters kleiner hadden dan de D_Fvan het substraat waarop ze werden geassembleerd;Met de mediane diameter van de GUV's is ongeveer 25 procent van de gemiddelde vezeldiameter.Hoewel de vorming van GUV's met een diameter groter dan D_Fwas statistisch zeldzaam, vanwege de hoge opbrengst van GUV's, werden ongeveer 100.000 blaasjes (die ongeveer 1% van het totale blaasje-aantal vertegenwoordigen) met diameters variërend van 20-60 urn, in 100 ul suspensies van blaasjes geassembleerd op G42 en katoen, verkregen.De verdeling van diameters van GUV's op de cellulosevezels voorafgaand aan het oogsten was vergelijkbaar met de verdeling van diameters van de geoogste GUV's.Langere incubatietijden, inclusief overnachting incubatie, veranderde de grootteverdeling van de GUV's niet.Uit deze resultaten kan worden geconcludeerd dat de diameters van de GUV's gerelateerd zijn aan de diameter van de cellulosevezels.

Katoenen stof en G42 -papier leverden een groter aantal GUV's op

Het aantal GUV's dat werd verkregen uit elk substraat werd ook gekwantificeerd.Om een ​​vergelijking tussen substraten mogelijk te maken, werden GUV -tellingen genormaliseerd tot de massa van lipide afgezet;d.w.z. het aantal GUV's per μg lipide (DOPC: TopFluor-PC) wordt gerapporteerd.Het gemiddelde aantal verkregen GUV's per μg lipide was vergelijkbaar voor GUV's geassembleerd op G41- en G1 -papier (Fig.6).De inzetstabel toont de variatiecoëfficiënt, die de variatie van de monster-naar-steekproef van GUV-opbrengsten parametreert.Het gemiddelde aantal GUV's per microgram lipide verkregen wanneer blaasjes werden geassembleerd op G42 -papier en katoenstof waren vergelijkbaar met elkaar, en ongeveer drie keer hoger dan het gemiddelde aantal GUV's verkregen uit G41- en G1 -papier (Fig.6).Monster-naar-sample variatie van het aantal GUV's dat uit katoenstof was geoogst, was lager dan de variatie van de monsters van de monsters van de papiermonsters (Fig.6, inzetstabel).Dit is waarschijnlijk te wijten aan de geordende opstelling van cellulosevezels in de stof.We merken op dat zelfs de lagere opbrengstpapier (G41 en G1) de GUV -opbrengsten overschrijden die zijn gerapporteerd voor elektroformatie⁴⁵.

Vergeleken met G41- en G1 -papieren hebben katoenen stof en G42 -papier lager D_F.Bovendien heeft G42 -papier een hoger deeltjesretentiecapaciteit en een lagere vloeistofstroomsnelheid, een weerspiegeling van de dichtere pakking van cellulosevezels en kleinere poriën.Hoewel de katoenen stof grote ramen bevat waarin er geen cellulose zich bevindt, tussen de orthogonale strengen garen, waren de cellulosevezels in het garen dicht verpakt.Deze gegevens suggereren dus dat substraten met kleinere gemiddelde vezeldiameters en dichtere pakking van cellulosevezels een groter aantal GUV's per massa -massa lipide opleveren.

Katoenen stof ondersteunt meerdere cycli van Guv -groei

Papier is een aantrekkelijk substraat voor het fabriceren van GUV's op het laboratoriumbank vanwege de lage kosten en wegwerpbaarheid.Op grotere schalen zijn de kosten van grondstoffen, de kosten van verwijdering en algemene duurzaamheid, herbruikbare substraten.Papier heeft een lage natte sterkte.Cellulose -stof daarentegen kan herhaalde mechanische beledigingen zoals slijtage en mechanisch wassen weerstaan.

Daarom werden experimenten uitgevoerd om te bepalen of stof opeenvolgende cycli van GUV -groei kan ondersteunen.Eén groeicyclus bestond uit de afzetting van lipiden, groei gedurende 60 minuten en vervolgens de oogst van de GUV's.Het reinigen en drogen van de stof na de oogst, en het afzetten van verse lipiden herhaalde de cyclus (zie hierboven voor gedetailleerde procedure).Vijf cycli werden uitgevoerd op een enkel stuk stof.Representatieve confocale beelden van GUV's verkregen uit ongerepte stof in de eerste cyclus, en GUV's verkregen uit de stof na vijf cycli vertoonden geen verschillen in blaasjesmorfologie.Kwantitatieve vergelijkingen bevestigden dat GUV -maten (Fig.7) en opbrengsten (Fig.8) waren vergelijkbaar in elk van de vijf cycli.Afgezien van een lichte krimp van het garen, was de stof na de vijfde groeicyclus niet te onderscheiden van stof afgebeeld na de eerste groeicyclus.Het is dus waarschijnlijk dat de stof meer dan 5 cycli van GUV -groei kan ondersteunen.

Deze experimenten geven aan dat het proces van GUV -groei de cellulosevezels niet verandert zoals waargenomen door confocale beeldvorming.De cellulosevezels werken als een promotor voor de snelle vorming van GUV's van lamellaire fosfolipide -stapels in waterige oplossingen;Het versnellen van de snelheid van vesiculatie van lamellaire stapels fosfolipiden vergeleken met de snelheid van vesiculatie op glas^13-17en blijven als extra voordeel ongewijzigd aan het einde van het proces.

Conclusies

Alle geteste cellulose-substraten produceerden populaties van GUV's met rechter-skewed unimodale distributies in diameters.De verdeling in de maten was vergelijkbaar tussen de verschillende substraten en werd begrensd door de gemiddelde diameter van de cellulosevezels.GUV -opbrengsten waren echter verschillend tussen de substraten;met de hoogste opbrengsten verkregen met G42-filterpapier en katoenen stof, en de laagste variatie op het monster-monster met katoenen stof.Bovendien ondersteunt katoenstof meerdere groeicycli en oogst zonder duidelijke verandering in de eigenschappen van de geproduceerde GUV's.Deze resultaten tonen aan dat katoenfabric een superieur substraat is voor het fabriceren van GUV's vanwege hoge opbrengsten en minimale variatie van monster-tot-monsters, en kunnen worden gebruikt om blaasjes te laten groeien, niet alleen van fosfolipiden zoals hierin beschreven, maar ook van andere lamellaire fasevormende amfifielen²⁶.

Voorbeeld 7: Vorming van blaasjes op nanofibrillaire cellulose -substraten

Cellulose -nanofibrillen kunnen verkregen uit cellulosevezels door mechanische homogenisatie met behulp van afschuiving, druk en/of chemische behandelingen.Om cellulose -nanofibrillen te verkrijgen, wordt 60 ml van een suspensie van 0,7 gew.Li Y-Y et al.(2018).Beoordeling van recente ontwikkeling bij voorbereiding, eigenschappen en toepassingen van op cellulose gebaseerde functionele materialen.Int J Polym Sci.;2018: 1-18.doi: 10.1155/2018/8973643.Het water mag bij kamertemperatuur verdampen, waardoor een dun vel nanopaper achterblijft.De nanopaper wordt spoelt en grondig gereinigd met chloroform en vervolgens water.Als alternatief commercieel traceringspapier, dat ook mechanisch en chemisch is verfijnd om een ​​dicht fibrillair oppervlak te verkrijgen, kan worden gebruikt.

Om het lipide-gecoate nanofibrillaire cellulosesubstraat te verkrijgen, werd een stuk diameter van het nanopaper van 9,5 mm, gemaakt zoals hierboven beschreven, uitgesneden en vervolgens 10 μg DOPC: topfluor-pc (99,5: 0,5 mol %) in chloroform werd afgezet op deoppervlak met een glazen spuit.Het met lipide gecoate nanofibrillaire cellulosepapier werd 1 uur in vacuüm geplaatst om sporen van oplosmiddel af te dringen.Na hydratatie bij 100 microliter van een waterige oplossing van 100 mm sucrose, gingen lamellaire stapels van amfifiele bilagen gevormd en gingen de vesiculatie in de loop van 2 uur.Blaasjes werden vrijgegeven uit het nanofibrillaire cellulose -oppervlak in de bulk waterige oplossing door de sucrose -oplossing over de nanovezels zes keer met een 1000 microliter pipet te aspireren.Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

Voorbeeld 8: Vorming van blaasjes op geregenereerde cellulosemembranen

Cellulose kan worden opgelost met behulp van geschikte oplosmiddelen.In aanwezigheid van natriumhydroxide reageert cellulose met koolstofdisulfide om natriumcellulose xanthaat te produceren.Het natriumcellulose xanthaat kan worden geëxtrudeerd in vezels of in vellen worden geworpen en, bij neutralisatie met zwavelzuur (h₂DUS₄), levert een viscose rayon of cellofaan.In dit voorbeeld werden commerciële geregenereerde cellulose -dialysemembranen gebruikt als substraten om gigantische blaasjes te vormen.Het membraan werd 15 minuten gewassen met ultrazekere water, gedurende 30 minuten in 10 mm EDTA, gedurende 30 minuten in 10 mm nahco₃bij 80 ° C en opnieuw gedurende 15 minuten in ultrazuinig water.Om met lipide gecoate geregenereerde cellulosemembranen te verkrijgen, werd een stuk diameter van geregenereerd cellulosemembraan met 9,5 mm gesneden en vervolgens 10 ug van 1,2-dioleoyl-glycero-3-fosfocholine (DOPC) in chloroform werd verspreid op het oppervlak met een oppervlak met eenspuit.Het met lipide gecoate geregenereerde cellulosemembraan werd 1 uur in vacuüm geplaatst om sporen van oplosmiddel af te dringen.Bij hydratatie was de vorming van dubbellaags onmiddellijk en de blaasing verliep in de loop van 2 uur.Vloeistofschaar aangebracht met een pipet die de blaasjes uit het membraan in de waterige oplossing bulk heeft vrijgegeven.

Voorbeeld 9: Vorming van blaasjes op zijdestof, nylonstof, polyesterweefsel en rayon -stof

De zijden en nylon stoffen waren beide gecoat met 50 ug DOPC -lipide in isopropanol.Het polyesterweefsel werd gecoat met 100 ug DOPC -lipide in isopropanol.Trace -isopropanol mocht 1 uur in een vacuüm verdampen.De gecoate stoffen werden vervolgens gedurende 1 uur gehydrateerd in waterige buffer en blaasjes werden uit de stof vrijgegeven door vloeistofschaar aan te brengen met een pipet.

Tabel 2 toont de moleculaire structuur, de gemiddelde vezelgroottes, het weefpatroon en het vocht herwinnen waarden van, zijde, wol, katoen, rayon, nylon, polyester en glasvezel.Vocht herwonnen is de hoeveelheid water die een volledig droge vezel zal absorberen uit de atmosfeer bij een standaardtemperatuur van 21 ° C en bij een relatieve vochtigheid van 65%.Tabelde waarden worden uitgedrukt als een percentage van het droge vezelgewicht.Vocht herwonnen is een proxy voor de hydrofiliciteit of affiniteit voor water van textiel.De herwin hangt waarschijnlijk ook af van de microstructuur en het specifieke oppervlak van de vezels in deze microstructureel gecompliceerde vezelachtige poreuze media.Zie ook Cook, J. G. Handboek van textielvezels: natuurlijke vezels, 5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984 en Cook, J. G. Handbook of textielvezels: door de mens gemaakte vezels, 5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984.

Fig.10toont scanning elektronenmicroscoopafbeeldingen van de stoffen.De zijde (Fig.10A), Rayon (Fig.10C), polyester (Fig.10D), nylon (Fig.10e) en glasvezel (Fig.10F) Stoffen hadden regelmatig cilindrische vezels met gladde oppervlakken opgesteld.Verder de rayon (Fig.10C), polyester (Fig.10D), nylon (Fig.10e) en glasvezel (Fig.10F) Vezels leken zeer uniform en weerspiegelden hun door de mens gemaakte aard.Hoewel cilindrisch, wol (Fig.10B) had een geschubd oppervlak en de opstelling van de vezels in de stof was minder regelmatig.

Voorbeeld 10: Vorming van blaasjes op zijden stof

Zijde is een natuurlijke vezel op basis van eiwitten.Cocons van de zijderwormBombyx Morizijn de primaire bron van commerciële zijde.Zijde vezels zijn samengesteld uit de onoplosbare eiwitfibroïne.De moleculaire structuur van zijde is rijk aan hydrofiele amidegroepen (tabel 2).Zijde heeft een vocht herwonnen van 8,5% die de hydrofiele aard ervan aangeeft.Zie bijvoorbeeld Cook, J. G.Handboek van textielvezels: natuurlijke vezels,5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984.

Silk (Silk Dupioni, heldere wit, 100% zijde) werd verkregen van een lokale ambachtswinkel (Joann, LLC, Merced, Californië).De stof werd gesneden in vierkanten van 10 cm x 10 cm.Twee stoffen vierkanten werden geplaatst in een 100 ml glazen media -fles met 100 ml chloroform (netjes) en de inhoud van de fles werd 30 minuten geroerd met behulp van een magnetische roerder en een Teflon® -roerbalk.Het proces werd twee keer herhaald, met behulp van verse chloroform elke keer;waarna de stof uit de fles werd verwijderd en de chloroform kon verdampen uit de stof.De stoffenvierkanten werden vervolgens in een 1 liter glazen media -fles met 1 liter ultrazamelwater geplaatst.Alternatieve cycli van weken en spoelen in water werden 3 uur voortgezet.Stoffenvierkanten mochten vervolgens drogen onder omgevingsomstandigheden en bewaard in schone plastic petrischalen.

Voor lipide-depositie en blaasjesvorming (GUV) werd een 2 mg/ml-oplossing van DOPC: TopFluor-PC (99,5: 0,5 mol %) bereid in chloroform (netjes).Voor dit voorbeeld en voorbeelden 11-15;1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (18: 1 (Δ9-cis) PC (DOPC) en 1-palmitoyl-2- (dipyrrometheneboron difluoride) undecanoyl-sn-glycero-3-f-f-phosfcholine (topfluor-pc) werden verkregen uit Avanti Polar Lipiden.Afgezette vloeistof mocht verdampen onder omgevingsomstandigheden, en de gedroogde stof werd vervolgens een uur in een vacuümkamer geplaatst om het resterende oplosmiddel af te stimuleren.werd 0,5 ml sucrose (100 mm in water) toegevoegd, waarna de buizen gedurende een uur onder omgevingsomstandigheden werden geïncubeerd om de groei van de blaasjes mogelijk te maken.

Om blaasjes te oogsten, werd een druppel van 0,1 ml 100 mm sucrose in water (bioxtra-graad, zuiverheid> 99,5%, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) geplaatst op een schone glazen deksel;en de stof werd uit de microcentrifugebuis verwijderd en snel ondergedompeld in de druppel.Blaasjes werden geoogst door de druppel voorzichtig in een micropipet -punt van 1 ml te aspireren, terwijl de punt (waarvan de opening was vergroot door het uiteinde van de punt af te snijden) systematisch over het oppervlak van de stofschijf.

Beelden van de droge stoffen werden verkregen door scanning elektronenmicroscopie (SEM) met behulp van een Geminisem 500 -veldemissie -scanning elektronenmicroscoop (Zeiss) met een bundelversnellingsspanning van 1 kV.Secundaire elektronen werden verzameld van het oppervlak van het stofsubstraat met behulp van een Everhart-Thomley secundaire elektronendetector.

Voor confocale beeldvorming werden vierkante beeldvormingskamers (6 mm breed x 6 mm lang x 1 mm hoog) vervaardigd uit polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan glazen microscoopglaasjes.De oppervlakken van de kamer werden gepassiveerd met caseïne (bioreagent graad van rundermelk, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) om breuk van blaasjes te voorkomen tijdens beeldvorming en voorbereiding op beeldvorming.Glucose (56 ul van een 100 mm waterige oplossing) (bioxtra-graad, zuiverheid> 99,5%, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) werd in de kamer geplaatst en een portie van 4 ul geoogste blaasjes werd aan de glucose toegevoegd aan de glucose toegevoegd aan de glucoseoplossing.Na 3 uur (gedurende welke tijd de met sucrose gevulde vesicles sedimenteerden tot de bodem van de kamer vanwege hun hogere dichtheid) werd een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop (Zeiss LSM 880 met AiryScan+Fast, Axio Imager.z2m) gebruikt om single te behalen-plane confocale beelden van het gehele gebied van de kamer met behulp van een geautomatiseerde tegelscanroutine (850,19 μm × 850,19 μm, 2140 pixels x 2140 pixels per afbeelding, 64 afbeeldingen).Een 10 × EC Planneofluar -doelstelling met een numerieke opening, Na = 0,3 werd gebruikt voor beeldvorming.De Topfluor -kleurstof was opgewonden met een argon -laser van 488 nm op 4% vermogen.Confocale z-stacks van GUV's die groeien op de vezels van de stof, met axiale spinger van 0,67 μM, werden verzameld met behulp van een 20 x W plan-apochromat water onderdompeling met een NA = 1,0.

Een aangepaste routine geschreven in Matlab (MathWorks Inc., Natick, Mass.) Werd gebruikt om de afbeeldingen te analyseren.De routine gebruikte een intensiteitsdrempel gevolgd door stroomgebiedsegmentatie om fluorescerende objecten uit de achtergrond te identificeren.Li et al.(2018)Biomacromoleculen19: 849-859.De Native RegionProps -routine tabelden de equivalente diameters en gemiddelde fluorescentie -intensiteiten van de objecten.GUV's werden onderscheiden van andere lipidenstructuren op basis van hun gemiddelde intensiteiten (Li et al., Supra) en hun grootte (> 1 μm).

Voorbeeld 11: Vorming van blaasjes op wol

Wol is een natuurlijke vezel op basis van eiwitten.Het fleece van schapen is de primaire bron van commerciële wolvezels.Wollen vezels zijn samengesteld uit het onoplosbare eiwit keratine.De moleculaire structuur van wol is rijk aan hydrofiele amidegroepen en hydrofobe covalent gehechte vetzuren (tabel 2).Wol heeft een vocht herwonnen van 16% die aangeeft dat de hydrofobe vetzuren de adsorptie van vocht niet remmen.Zie bijvoorbeeld Cook, J. G.Handboek van textielvezels: natuurlijke vezels,5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984.

Wol (100% merinowolvergrendeling - washable) werd verkregen van de stoffen van de natuur (Edinboro, Pa.).De stof werd gesneden in vierkanten van 10 cm x 10 cm.Twee stoffen vierkanten werden geplaatst in een 100 ml glazen media -fles met 100 ml chloroform (netjes) en de inhoud van de fles werd 30 minuten geroerd met behulp van een magnetische roerder en een Teflon® -roerbalk.Het proces werd twee keer herhaald, met behulp van verse chloroform elke keer;waarna de stof uit de fles werd verwijderd en de chloroform kon verdampen uit de stof.De stoffenvierkanten werden vervolgens in een 1 liter glazen media -fles met 1 liter ultrazamelwater geplaatst.Alternatieve cycli van weken en spoelen in water werden 3 uur voortgezet.Stoffenvierkanten mochten vervolgens drogen onder omgevingsomstandigheden en bewaard in schone plastic petrischalen.

Voor lipide-depositie en blaasjesvorming (GUV) werd een 2 mg/ml-oplossing van DOPC: TopFluor-PC (99,5: 0,5 mol %) bereid in chloroform (netjes).Schijven van stof met een diameter van 9,5 mm werden gesneden uit de gereinigde, gedroogde stofvierkanten.Lipide -oplossing werd afgezet op de schijven om een ​​concentratie van 1,5 μg lipide -oplossing per milligram stofsubstraat te verschaffen.De afgezette vloeistof mocht verdampen onder omgevingsomstandigheden en het gedroogde stof werd vervolgens een uur in een vacuümkamer geplaatst om het resterende oplosmiddel af te stimuleren.De stoffenschijven werden vervolgens uit het vacuüm verwijderd en elke schijf werd in een microcentrifugebuis geplaatst waaraan 0,5 ml sucrose (100 mm in water) werd toegevoegd, waarna de buizen gedurende een uur werden geïncubeerd onder omgevingsomstandigheden om de groei van de blaasjes mogelijk te maken.

Om blaasjes te oogsten, werd een druppel van 0,1 ml 100 mm sucrose in water op een schone glazen dekglip geplaatst;en de stof werd uit de microcentrifugebuis verwijderd en snel ondergedompeld in de druppel.Blaasjes werden geoogst door de druppel voorzichtig in een micropipet -punt van 1 ml te aspireren, terwijl de punt (waarvan de opening was vergroot door het uiteinde van de punt af te snijden) systematisch over het oppervlak van de stofschijf.

Beelden van de droge stoffen werden verkregen door scanning elektronenmicroscopie (SEM) met behulp van een Geminisem 500 -veldemissie -scanning elektronenmicroscoop (Zeiss) met een bundelversnellingsspanning van 1 kV.Secundaire elektronen werden verzameld van het oppervlak van het stofsubstraat met behulp van een Everhart-Thomley secundaire elektronendetector.

Voor confocale beeldvorming werden vierkante beeldvormingskamers (6 mm breed x 6 mm lang x 1 mm hoog) vervaardigd uit polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan glazen microscoopglaasjes.De oppervlakken van de kamer werden gepassiveerd met caseïne om breuk van blaasjes te voorkomen tijdens beeldvorming en voorbereiding op beeldvorming.Glucose (56 ul van een waterige oplossing van 100 mm) werd in de kamer geplaatst en een hoeveelheid van 4 ul geoogste blaasjesoplossing werd aan de glucoseoplossing toegevoegd.Na 3 uur (gedurende welke tijd de met sucrose gevulde vesicles sedimenteerden tot de bodem van de kamer vanwege hun hogere dichtheid) werd een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop (Zeiss LSM 880 met AiryScan+Fast, Axio Imager.z2m) gebruikt om single te behalen-plane confocale beelden van het gehele gebied van de kamer met behulp van een geautomatiseerde tegelscanroutine (850,19 μm × 850,19 μm, 2140 pixels x 2140 pixels per afbeelding, 64 afbeeldingen).Een 10 × EC Planneofluar -doelstelling met een numerieke opening, Na = 0,3 werd gebruikt voor beeldvorming.De Topfluor -kleurstof was opgewonden met een argon -laser van 488 nm op 4% vermogen.Confocale z-stacks van GUV's die groeien op de vezels van de stof, met axiale spinger van 0,67 μM, werden verzameld met behulp van een 20 x W plan-apochromat water onderdompeling met een NA = 1,0.

Een aangepaste routine geschreven in Matlab (MathWorks Inc., Natick, Mass.) Werd gebruikt om de afbeeldingen te analyseren.De routine gebruikte een intensiteitsdrempel gevolgd door stroomgebiedsegmentatie om fluorescerende objecten uit de achtergrond te identificeren.Li et al.(2018)Biomacromoleculen19: 849-859.De Native RegionProps -routine tabelden de equivalente diameters en gemiddelde fluorescentie -intensiteiten van de objecten.GUV's werden onderscheiden van andere lipidenstructuren op basis van hun gemiddelde intensiteiten (Li et al., Supra) en hun grootte (> 1 μm).

Voorbeeld 12: Vorming van blaasjes op Rayon -stof

Wet-spanning van een cellulose-oplossing door een spinneret gevolgd door chemische regeneratie van de cellulosepolymeren resulteert in lange vezels van rayon met geregelde grootte en kristalliniteit.Dit proces zet korte cellulosevezels van houtachtige materialen om in lange vezels die lijken op katoen of zijde.Rayon is een semisynthetische vezel omdat de grondstof afkomstig is van een natuurlijke bron.Natuurlijke bio-afgeleide cellulose heeft een cellulose I-kristalstructuur.Geregenereerde cellulose heeft een cellulose II -kristalstructuur.Net als katoen is Rayon rijk aan hydrofiele hydroxylgroepen (tabel 2).Rayon heeft een vocht herwonnen van 11%.Zie bijvoorbeeld Cook, J. G.Handboek van textielvezels: man-Vezels gemaakt,5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984.

Rayon (Sportswear Modal Fabric, White, 100% Rayon) werd verkregen van een lokale ambachtelijke winkel (Joann, LLC, Merced, Californië).De stof werd gesneden in vierkanten van 10 cm x 10 cm.Twee stoffen vierkanten werden geplaatst in een 100 ml glazen media -fles met 100 ml chloroform (netjes) en de inhoud van de fles werd 30 minuten geroerd met behulp van een magnetische roerder en een Teflon® -roerbalk.Het proces werd twee keer herhaald, met behulp van verse chloroform elke keer;waarna de stof uit de fles werd verwijderd en de chloroform kon verdampen uit de stof.De stoffenvierkanten werden vervolgens in een 1 liter glazen media -fles met 1 liter ultrazamelwater geplaatst.Alternatieve cycli van weken en spoelen in water werden 3 uur voortgezet.Stoffenvierkanten mochten vervolgens drogen onder omgevingsomstandigheden en bewaard in schone plastic petrischalen.

Voor lipide-depositie en blaasjesvorming (GUV) werd een 2 mg/ml-oplossing van DOPC: TopFluor-PC (99,5: 0,5 mol %) bereid in chloroform (netjes).Schijven van stof met een diameter van 9,5 mm werden gesneden uit de gereinigde, gedroogde stofvierkanten.Lipide -oplossing werd afgezet op de schijven om een ​​concentratie van 3 μg lipide -oplossing te verschaffen per milligram stofsubstraat.De afgezette vloeistof mocht verdampen onder omgevingsomstandigheden en het gedroogde stof werd vervolgens een uur in een vacuümkamer geplaatst om het resterende oplosmiddel af te stimuleren.De stoffenschijven werden vervolgens uit het vacuüm verwijderd en elke schijf werd in een microcentrifugebuis geplaatst waaraan 0,5 ml sucrose (100 mm in water) werd toegevoegd, waarna de buizen gedurende een uur werden geïncubeerd onder omgevingsomstandigheden om de groei van de blaasjes mogelijk te maken.

Om blaasjes te oogsten, werd een druppel van 0,1 ml 100 mm sucrose in water op een schone glazen dekglip geplaatst;en de stof werd uit de microcentrifugebuis verwijderd en snel ondergedompeld in de druppel.Blaasjes werden geoogst door de druppel voorzichtig in een micropipet -punt van 1 ml te aspireren, terwijl de punt (waarvan de opening was vergroot door het uiteinde van de punt af te snijden) systematisch over het oppervlak van de stofschijf.

Beelden van de droge stoffen werden verkregen door scanning elektronenmicroscopie (SEM) met behulp van een Geminisem 500 -veldemissie -scanning elektronenmicroscoop (Zeiss) met een bundelversnellingsspanning van 1 kV.Secundaire elektronen werden verzameld van het oppervlak van het stofsubstraat met behulp van een Everhart-Thomley secundaire elektronendetector.

Voor confocale beeldvorming werden vierkante beeldvormingskamers (6 mm breed x 6 mm lang x 1 mm hoog) vervaardigd uit polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan glazen microscoopglaasjes.De oppervlakken van de kamer werden gepassiveerd met caseïne om breuk van blaasjes te voorkomen tijdens beeldvorming en voorbereiding op beeldvorming.Glucose (58 ul van een waterige oplossing van 100 mm) werd in de kamer geplaatst en een hoeveelheid van 2 ul geoogste blaasjesoplossing werd aan de glucoseoplossing toegevoegd.Na 3 uur (gedurende welke tijd de met sucrose gevulde vesicles sedimenteerden tot de bodem van de kamer vanwege hun hogere dichtheid) werd een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop (Zeiss LSM 880 met AiryScan+Fast, Axio Imager.z2m) gebruikt om single te behalen-plane confocale beelden van het gehele gebied van de kamer met behulp van een geautomatiseerde tegelscanroutine (850,19 μm × 850,19 μm, 2140 pixels x 2140 pixels per afbeelding, 64 afbeeldingen).Een 10 × EC Planneofluar -doelstelling met een numerieke opening, Na = 0,3 werd gebruikt voor beeldvorming.De Topfluor -kleurstof was opgewonden met een argon -laser van 488 nm op 4% vermogen.Confocale z-stacks van GUV's die groeien op de vezels van de stof, met axiale spinger van 0,67 μM, werden verzameld met behulp van een 20 x W plan-apochromat water onderdompeling met een NA = 1,0.

Een aangepaste routine geschreven in Matlab (MathWorks Inc., Natick, Mass.) Werd gebruikt om de afbeeldingen te analyseren.De routine gebruikte een intensiteitsdrempel gevolgd door stroomgebiedsegmentatie om fluorescerende objecten uit de achtergrond te identificeren.Li et al.(2018)Biomacromoleculen19: 849-859.De Native RegionProps -routine tabelden de equivalente diameters en gemiddelde fluorescentie -intensiteiten van de objecten.GUV's werden onderscheiden van andere lipidenstructuren op basis van hun gemiddelde intensiteiten (Li et al., Supra) en hun grootte (> 1 μm).

Voorbeeld 13: Vorming van blaasjes op nylonstof

Nylon 6,6 is een synthetische vezel gemaakt door smelt-spinning polyamiden die het gevolg zijn van de polycondensatie van hexamethyleendiamine en adipinezuur.De moleculaire structuur van nylon 6,6 is rijk aan hydrofiele amiden.Nylon heeft een vocht herwonnen van 4,0-4,5% (tabel 2).De grondstof voor nylon is afkomstig van petroleumbijproducten, zie bijvoorbeeld Cook, J. G.Handboek van textielvezels: man-Vezels gemaakt,5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984.

Nylon (Sport Nylon Fabric, wit, 100% nylon) werd verkregen uit een lokale ambachtswinkel (Joann, LLC, Merced, Californië).De stof werd gesneden in vierkanten van 10 cm x 10 cm.Twee stoffen vierkanten werden geplaatst in een 100 ml glazen media -fles met 100 ml chloroform (netjes) en de inhoud van de fles werd 30 minuten geroerd met behulp van een magnetische roerder en een Teflon® -roerbalk.Het proces werd twee keer herhaald, met behulp van verse chloroform elke keer;waarna de stof uit de fles werd verwijderd en de chloroform kon verdampen uit de stof.De stoffenvierkanten werden vervolgens in een 1 liter glazen media -fles met 1 liter ultrazamelwater geplaatst.Alternatieve cycli van weken en spoelen in water werden 3 uur voortgezet.Stoffenvierkanten mochten vervolgens drogen onder omgevingsomstandigheden en bewaard in schone plastic petrischalen.

Voor lipide-depositie en blaasjesvorming (GUV) werd een 2 mg/ml-oplossing van DOPC: TopFluor-PC (99,5: 0,5 mol %) bereid in chloroform (netjes).Schijven van stof met een diameter van 9,5 mm werden gesneden uit de gereinigde, gedroogde stofvierkanten.Lipide -oplossing werd afgezet op de schijven om een ​​concentratie van 3 μg lipide -oplossing te verschaffen per milligram stofsubstraat.De afgezette vloeistof mocht verdampen onder omgevingsomstandigheden en het gedroogde stof werd vervolgens een uur in een vacuümkamer geplaatst om het resterende oplosmiddel af te stimuleren.De stoffenschijven werden vervolgens uit het vacuüm verwijderd en elke schijf werd in een microcentrifugebuis geplaatst waaraan 0,5 ml sucrose (100 mm in water) werd toegevoegd, waarna de buizen gedurende een uur werden geïncubeerd onder omgevingsomstandigheden om de groei van de blaasjes mogelijk te maken.

Om blaasjes te oogsten, werd een druppel van 0,1 ml 100 mm sucrose in water op een schone glazen dekglip geplaatst;en de stof werd uit de microcentrifugebuis verwijderd en snel ondergedompeld in de druppel.Blaasjes werden geoogst door de druppel voorzichtig in een micropipet -punt van 1 ml te aspireren, terwijl de punt (waarvan de opening was vergroot door het uiteinde van de punt af te snijden) systematisch over het oppervlak van de stofschijf.

Beelden van de droge stoffen werden verkregen door scanning elektronenmicroscopie (SEM) met behulp van een Geminisem 500 -veldemissie -scanning elektronenmicroscoop (Zeiss) met een bundelversnellingsspanning van 1 kV.Secundaire elektronen werden verzameld van het oppervlak van het stofsubstraat met behulp van een Everhart-Thomley secundaire elektronendetector.

Voor confocale beeldvorming werden vierkante beeldvormingskamers (6 mm breed x 6 mm lang x 1 mm hoog) vervaardigd uit polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan glazen microscoopglaasjes.De oppervlakken van de kamer werden gepassiveerd met caseïne om breuk van blaasjes te voorkomen tijdens beeldvorming en voorbereiding op beeldvorming.Glucose (56 ul van een waterige oplossing van 100 mm) werd in de kamer geplaatst en een hoeveelheid van 4 ul geoogste blaasjesoplossing werd aan de glucoseoplossing toegevoegd.Na 3 uur (gedurende welke tijd de met sucrose gevulde vesicles sedimenteerden tot de bodem van de kamer vanwege hun hogere dichtheid) werd een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop (Zeiss LSM 880 met AiryScan+Fast, Axio Imager.z2m) gebruikt om single te behalen-plane confocale beelden van het gehele gebied van de kamer met behulp van een geautomatiseerde tegelscanroutine (850,19 μm × 850,19 μm, 2140 pixels x 2140 pixels per afbeelding, 64 afbeeldingen).Een 10 × EC Planneofluar -doelstelling met een numerieke opening, Na = 0,3 werd gebruikt voor beeldvorming.De Topfluor -kleurstof was opgewonden met een argon -laser van 488 nm op 4% vermogen.Confocale z-stacks van GUV's die groeien op de vezels van de stof, met axiale spinger van 0,67 μM, werden verzameld met behulp van een 20 x W plan-apochromat water onderdompeling met een NA = 1,0.

Een aangepaste routine geschreven in Matlab (MathWorks Inc., Natick, Mass.) Werd gebruikt om de afbeeldingen te analyseren.De routine gebruikte een intensiteitsdrempel gevolgd door stroomgebiedsegmentatie om fluorescerende objecten uit de achtergrond te identificeren.Li et al.(2018)Biomacromoleculen19: 849-859.De Native RegionProps -routine tabelden de equivalente diameters en gemiddelde fluorescentie -intensiteiten van de objecten.GUV's werden onderscheiden van andere lipidenstructuren op basis van hun gemiddelde intensiteiten (Li et al., Supra) en hun grootte (> 1 μm).

Voorbeeld 14: Vorming van blaasjes op polyesterweefsel

Polyestervezels zijn smelt-gesponnen polyethyleentereftalaat.Samen met hydrofiele carbonylgroepen is polyester rijk aan hydrofobe aromatische en methylgroepen (tabel 2).Polyester heeft een lage vocht herwonnen van 0,4%.De grondstof voor polyester is afkomstig van petroleum bijproducten.Zie bijvoorbeeld Cook, J. G.Handboek van textielvezels: man-Vezels gemaakt,5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984.

Polyester (satijn tafetta, wit, 100% polyester) werd verkregen van een lokale ambachtswinkel (Joann, LLC, Merced, Californië).De stof werd gesneden in vierkanten van 10 cm x 10 cm.Twee stoffen vierkanten werden geplaatst in een 100 ml glazen media -fles met 100 ml chloroform (netjes) en de inhoud van de fles werd 30 minuten geroerd met behulp van een magnetische roerder en een Teflon® -roerbalk.Het proces werd twee keer herhaald, met behulp van verse chloroform elke keer;waarna de stof uit de fles werd verwijderd en de chloroform kon verdampen uit de stof.De stoffenvierkanten werden vervolgens in een 1 liter glazen media -fles met 1 liter ultrazamelwater geplaatst.Alternatieve cycli van weken en spoelen in water werden 3 uur voortgezet.Stoffenvierkanten mochten vervolgens drogen onder omgevingsomstandigheden en bewaard in schone plastic petrischalen.

Voor lipide-depositie en blaasjesvorming (GUV) werd een 2 mg/ml-oplossing van DOPC: TopFluor-PC (99,5: 0,5 mol %) bereid in chloroform (netjes).Schijven van stof met een diameter van 9,5 mm werden gesneden uit de gereinigde, gedroogde stofvierkanten.Lipide -oplossing werd afgezet op de schijven om een ​​concentratie van 3 μg lipide -oplossing te verschaffen per milligram stofsubstraat.De afgezette vloeistof mocht verdampen onder omgevingsomstandigheden en het gedroogde stof werd vervolgens een uur in een vacuümkamer geplaatst om het resterende oplosmiddel af te stimuleren.De stoffenschijven werden vervolgens uit het vacuüm verwijderd en elke schijf werd in een microcentrifugebuis geplaatst waaraan 0,5 ml sucrose (100 mm in water) werd toegevoegd, waarna de buizen gedurende een uur werden geïncubeerd onder omgevingsomstandigheden om de groei van de blaasjes mogelijk te maken.

Om blaasjes te oogsten, werd een druppel van 0,1 ml 100 mm sucrose in water op een schone glazen dekglip geplaatst;en de stof werd uit de microcentrifugebuis verwijderd en snel ondergedompeld in de druppel.Blaasjes werden geoogst door de druppel voorzichtig in een micropipet -punt van 1 ml te aspireren, terwijl de punt (waarvan de opening was vergroot door het uiteinde van de punt af te snijden) systematisch over het oppervlak van de stofschijf.

Beelden van de droge stoffen werden verkregen door scanning elektronenmicroscopie (SEM) met behulp van een Geminisem 500 -veldemissie -scanning elektronenmicroscoop (Zeiss) met een bundelversnellingsspanning van 1 kV.Secundaire elektronen werden verzameld van het oppervlak van het stofsubstraat met behulp van een Everhart-Thomley secundaire elektronendetector.

Voor confocale beeldvorming werden vierkante beeldvormingskamers (6 mm breed x 6 mm lang x 1 mm hoog) vervaardigd uit polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan glazen microscoopglaasjes.De oppervlakken van de kamer werden gepassiveerd met caseïne om breuk van blaasjes te voorkomen tijdens beeldvorming en voorbereiding op beeldvorming.Glucose (56 ul van een waterige oplossing van 100 mm) werd in de kamer geplaatst en een hoeveelheid van 4 ul geoogste blaasjesoplossing werd aan de glucoseoplossing toegevoegd.Na 3 uur (gedurende welke tijd de met sucrose gevulde vesicles sedimenteerden tot de bodem van de kamer vanwege hun hogere dichtheid) werd een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop (Zeiss LSM 880 met AiryScan+Fast, Axio Imager.z2m) gebruikt om single te behalen-plane confocale beelden van het gehele gebied van de kamer met behulp van een geautomatiseerde tegelscanroutine (850,19 μm × 850,19 μm, 2140 pixels x 2140 pixels per afbeelding, 64 afbeeldingen).Een 10 × EC Planneofluar -doelstelling met een numerieke opening, Na = 0,3 werd gebruikt voor beeldvorming.De Topfluor -kleurstof was opgewonden met een argon -laser van 488 nm op 4% vermogen.Confocale z-stacks van GUV's die groeien op de vezels van de stof, met axiale spinger van 0,67 μM, werden verzameld met behulp van een 20 x W plan-apochromat water onderdompeling met een NA = 1,0.

Een aangepaste routine geschreven in Matlab (MathWorks Inc., Natick, Mass.) Werd gebruikt om de afbeeldingen te analyseren.De routine gebruikte een intensiteitsdrempel gevolgd door stroomgebiedsegmentatie om fluorescerende objecten uit de achtergrond te identificeren.Li et al.(2018)Biomacromoleculen19: 849-859.De Native RegionProps -routine tabelden de equivalente diameters en gemiddelde fluorescentie -intensiteiten van de objecten.GUV's werden onderscheiden van andere lipidenstructuren op basis van hun gemiddelde intensiteiten (Li et al., Supra) en hun grootte (> 1 μm).

Voorbeeld 15: Vorming van blaasjes op glasvezelstof

Glasvezel wordt gestold geëxtrudeerd gesmolten glas.Vezelglas is hydrofiel vanwege de aanwezigheid van veel oppervlakteshydroxylgroep (tabel 2).Zie bijvoorbeeld Cook, J. G.Handboek van textielvezels: man-Vezels gemaakt,5e ed.;Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 1984.

Gewoon geweven glasvezelstof (3 oz stofstijl120 e-glas) werd verkregen van Fiber Glast Developments Corp. (Brookville, Ohio).De stof werd gesneden in vierkanten van 10 cm x 10 cm.Twee stoffen vierkanten werden geplaatst in een 100 ml glazen media -fles met 100 ml chloroform (netjes) en de inhoud van de fles werd 30 minuten geroerd met behulp van een magnetische roerder en een Teflon® -roerbalk.Het proces werd twee keer herhaald, met behulp van verse chloroform elke keer;waarna de stof uit de fles werd verwijderd en de chloroform kon verdampen uit de stof.De stoffenvierkanten werden vervolgens in een 1 liter glazen media -fles met 1 liter ultrazamelwater geplaatst.Alternatieve cycli van weken en spoelen in water werden 3 uur voortgezet.Stoffenvierkanten mochten vervolgens drogen onder omgevingsomstandigheden en bewaard in schone plastic petrischalen.

Voor lipide-depositie en blaasjesvorming (GUV) werd een 2 mg/ml-oplossing van DOPC: TopFluor-PC (99,5: 0,5 mol %) bereid in chloroform (netjes).Schijven van stof met een diameter van 9,5 mm werden gesneden uit de gereinigde, gedroogde stofvierkanten.Lipide -oplossing werd afgezet op de schijven om een ​​concentratie van 3 μg lipide -oplossing te verschaffen per milligram stofsubstraat.De afgezette vloeistof mocht verdampen onder omgevingsomstandigheden en het gedroogde stof werd vervolgens een uur in een vacuümkamer geplaatst om het resterende oplosmiddel af te stimuleren.De stoffenschijven werden vervolgens uit het vacuüm verwijderd en elke schijf werd in een microcentrifugebuis geplaatst waaraan 0,5 ml sucrose (100 mm in water) werd toegevoegd, waarna de buizen gedurende een uur werden geïncubeerd onder omgevingsomstandigheden om de groei van de blaasjes mogelijk te maken.

Om blaasjes te oogsten, werd een druppel van 0,1 ml 100 mm sucrose in water op een schone glazen dekglip geplaatst;en de stof werd uit de microcentrifugebuis verwijderd en snel ondergedompeld in de druppel.Blaasjes werden geoogst door de druppel voorzichtig in een micropipet -punt van 1 ml te aspireren, terwijl de punt (waarvan de opening was vergroot door het uiteinde van de punt af te snijden) systematisch over het oppervlak van de stofschijf.

Beelden van de droge stoffen werden verkregen door scanning elektronenmicroscopie (SEM) met behulp van een Geminisem 500 -veldemissie -scanning elektronenmicroscoop (Zeiss) met een bundelversnellingsspanning van 1 kV.Secundaire elektronen werden verzameld van het oppervlak van het stofsubstraat met behulp van een Everhart-Thomley secundaire elektronendetector.

Voor confocale beeldvorming werden vierkante beeldvormingskamers (6 mm breed x 6 mm lang x 1 mm hoog) vervaardigd uit polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan glazen microscoopglaasjes.De oppervlakken van de kamer werden gepassiveerd met caseïne om breuk van blaasjes te voorkomen tijdens beeldvorming en voorbereiding op beeldvorming.Glucose (56 ul van een waterige oplossing van 100 mm) werd in de kamer geplaatst en een hoeveelheid van 4 ul geoogste blaasjesoplossing werd aan de glucoseoplossing toegevoegd.Na 3 uur (gedurende welke tijd de met sucrose gevulde vesicles sedimenteerden tot de bodem van de kamer vanwege hun hogere dichtheid) werd een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop (Zeiss LSM 880 met AiryScan+Fast, Axio Imager.z2m) gebruikt om single te behalen-plane confocale beelden van het gehele gebied van de kamer met behulp van een geautomatiseerde tegelscanroutine (850,19 μm × 850,19 μm, 2140 pixels x 2140 pixels per afbeelding, 64 afbeeldingen).Een 10 × EC Planneofluar -doelstelling met een numerieke opening, Na = 0,3 werd gebruikt voor beeldvorming.De Topfluor -kleurstof was opgewonden met een argon -laser van 488 nm op 4% vermogen.Confocale z-stacks van GUV's die groeien op de vezels van de stof, met axiale spinger van 0,67 μM, werden verzameld met behulp van een 20 x W plan-apochromat water onderdompeling met een NA = 1,0.

Een aangepaste routine geschreven in Matlab (MathWorks Inc., Natick, Mass.) Werd gebruikt om de afbeeldingen te analyseren.De routine gebruikte een intensiteitsdrempel gevolgd door stroomgebiedsegmentatie om fluorescerende objecten uit de achtergrond te identificeren.Li et al.(2018)Biomacromoleculen19: 849-859.De Native RegionProps -routine tabelden de equivalente diameters en gemiddelde fluorescentie -intensiteiten van de objecten.GUV's werden onderscheiden van andere lipidenstructuren op basis van hun gemiddelde intensiteiten (Li et al., Supra) en hun grootte (> 1 μm).

Voorbeeld 16: Vergelijking van blaasjes gevormd op natuurlijke, semi-synthetische en synthetische stoffen

Alle stoffen bevorderden vesiculatie van GUV's op hun vezels.

Fig.11toont confocale microscoopbeelden van de lipide-gecoate stoffen een uur na incubatie in de waterige buffer.Alle geteste stoffen lieten GUV's groeien van de oppervlakken van hun vezels.De meeste GUV's hadden de lipide -laag de vezels bedekt.Li et al.(2018)Biomacromoleculen19: 849-859.Deze resultaten tonen aan dat de spontane vorming van GUV's niet beperkt is tot cellulose, maar algemene vezels is van verschillende oppervlaktechemie.

De configuratie en overvloed van GUV's, en de aard en overvloed van andere lamellaire structuren, verschilden op de diverse stoffen.Silk en Rayon hadden bolvormige GUV's die kwalitatief leken op die te zien op cellulosepapier en cellulose -stof.Zie voorbeelden supra.GUV's waren zeer overvloedig op deze stoffen (zijde en rayon) en bedekten de vezels in gestapelde lagen die de poriën tussen de vezels van de stof vulden.Wol had merkbaar minder GUV's dan de andere stoffen.Nylon, polyester en glasvezelstoffen hadden een tussenliggend aantal GUV's.We hebben opgemerkt dat GUV's alleen uit de lipidelaag vormden die de vezels bekleedde.Aan de andere kant, niet-GUV, multilamellaire lipidenstructuren gevormd uit lipidenafzettingen die de gaten tussen de vezels uitspande (Fig.12).Deze lipideafzettingen kwamen vaker voor op wol, nylon, polyester en glasvezel dan op rayon, zijde of katoen.Samen met GUV's waren dus een aanzienlijk aantal andere lamellaire structuren aanwezig op de stoffen van wol, nylon, polyester en glasvezel.Furthermore, giant polymer vesicles from the amphiphilic diblock copolymer poly(butadiene-b-ethyleneoxide) PBD46PEO30 and the amphiphilic triblock copolymer polyoxyethylene-polyoxypropylene-polyoxyethylene (PEO5PPO67PEO5, Pluronic L121) also formed on all the fabrics, showing that vesicle growth on fibers is generalnaar andere lamellaire fasevormende amfifielen.

De stoffen produceerden verschillende aantallen GUV's per massa lipide -eenheid.

Lipidenstructuren werden geoogst uit de stoffen zoals hierboven beschreven, en, nadat de structuren gedurende 3 uur in een aangepaste beeldvormingskamer werden toegestaan, werden aliquots uit de suspensies onderzocht door confocale fluorescentiemicroscopie.Een fractie van GUV's en andere structuren blijven in het weefsel gevangen na het oogstproces, zoals eerder waargenomen.Kresse et al.(2016) ACS Appl.Mater.Interfaces 8: 32102-32107;Li et al., Supra;Pazzi et al., "Grootteverdelingen en opbrengsten van gigantische blaasjes geassembleerd op cellulosepapieren en katoenen stof," Langmuir, in druk.Fig.13((A-F) toont typische gezichtsvelden verkregen uit een hoeveelheid van 4 ul van de geoogste oplossing verdund in 56 ul isomolaire glucosebuffer.Structuren geoogst uit zijde en rayon, vergelijkbaar met die van katoenstof en cellulosepapier (Pazzi et al., Supra), leken overwegend Guvs te zijn.In overeenstemming met directe waarnemingen van de structuren op de stoffen, waren een grotere fractie van lipide -aggregaten, lipide nanobuisjes en puin aanwezig in de monsters geoogst uit wol, nylon, polyester en glasvezel.Voor alle stoffen was het aantal GUV's in een typisch veldaanzicht voldoende om biofysische experimenten uit te voeren (bijv. Walde et al. (2010)Chembiochem.11: 848-865;Dimova et al.(2006)J Phys.Condens.Materie18: S1151-51176;Steer et al.(2018)Langmuir34: 7561-7574;Dietrich et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.VS98: 10642-10647;Veatch et al.(2003)Biophys.J.85: 3074-3083), hoewel sommige meer lipide puin en andere niet-GUV-structuren hadden.

Om kwantitatief inzicht in de maten en opbrengsten van de GUV's te verkrijgen, werden afbeeldingen geanalyseerd met behulp van een aangepaste MATLAB -routine (Pazzi et al., Supra).Drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd voor elk type stof.Elk experiment had grote steekproefgroottes variërend van n = (10⁴) tot (10⁵) Guvs.GUV's werden geïdentificeerd op basis van hun fluorescentie -intensiteit (Li et al. (2018) supra) en hun grootte (> 1 μm diameter).Fig.14toont een barplot van het aantal GUV's verkregen uit de stoffen die in afnemende volgorde zijn gerangschikt van links naar rechts.De hoogte van de balk is het gemiddelde van de drie experimenten voor elk stoftype.De punten zijn de tellingen van de drie onafhankelijke experimenten.Om een ​​vergelijking tussen de stoffen mogelijk te maken, werd GUV -telling genormaliseerd op de massa lipide afgezet op elke stof.Over het algemeen produceerde Rayon het hoogste gemiddelde aantal GUV's per massa -massa van afgezette lipide bij 2,6 × 10⁵GUV's per μg lipide, terwijl wol het laagste gemiddelde aantal GUV's had op 6,2 x 10⁴GUV's per μg lipide.Rayon, Nylon en Polyester hadden een grotere variatie in het monster-monster in GUV-getallen dan de andere stoffen.

Vergelijkbaar met wat is waargenomen met katoenstof (Pazzi et al. (2018) supra), veranderde het proces van GUV -groei de vezels van de stoffen niet.Alle stoffen ondersteunden ten minste vijf cycli van GUV -groei en oogst, zonder meetbare veranderingen in de kenmerken van de GUV's.

De verdeling van GUV -maten varieerde tussen de stoffen.

Maten van GUV's verkregen uit de verschillende stoffen werden geanalyseerd.Fig.15toont een histogram van de diameters van de GUV's geoogst uit zijde.De bin -breedte is 1 μm en de steekproefgrootte, n = 113,461.De verdeling van de diameters was unimodaal met een prominente rechterstaart.Kleinere GUV's waren overvloediger dan grotere GUV's.Populaties van GUV's die zijn geoogst uit de andere stoffen vertoonde ook vergelijkbare unimodale rechter-skewed distributies van diameters (Fig.16).Deze resultaten dragen verder bij aan de groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal dat populaties van GUV's verkregen uit de vesiculatie van lamellaire stapels fosfolipiden op ongelijksoortige oppervlakken zoals vaste glas, hydrogels en cilindrische vezels brede en rechts-geëxciteerde distributies in diameters hebben in diameters.Reeves & Dowben (1969)J. Cell.Physiol.73: 49-60;López Mora et al.(2014)Chem.Commun.50: 1953-1955;Movsesian et al.(2018)Langmuir34: 9025-9035;Peruzzi et al.(2016)Langmuir32: 12702-12709;Greene et al.(2016)PLOS One11: E0158729;Kresse et al., Supra, Li et al., Supra, Pazzi et al., Supra.Zonder gebonden te zijn aan een bepaalde theorie, suggereert de gelijkenis in grootteverdelingen de mogelijkheid van vergelijkbare onderliggende dynamiek die de processen van blaas en groei regelen.

Fig.17toont empirische cumulatieve verdelingsfuncties van de populaties van GUV's verkregen uit elke stof.De punten zijn de gemiddelde cumulatieve waarschijnlijkheid van de drie experimenten.De foutbalken zijn de standaardafwijking van het gemiddelde.Mediane diameters voor elke populatie worden weergegeven in tabel 3. Over het algemeen had achtennegentig procent van de GUV's geoogst van alle stoffen diameters <20 μm.Populaties van GUV's geoogst uit zijde hadden de hoogste fractie van GUV's met grotere diameters;met een mediane diameter van 3,7 ± 0,3 μm.Monsters geoogst uit wol en glasvezel hadden de kleinste fractie van GUV's met grotere diameters;met mediane diameters van respectievelijk 2,7 ± 0,3 μm en 2,5 ± 0,1 μm.Populaties van GUV's geoogst uit katoen en rayon hadden een vergelijkbare cumulatieve verdeling bij diameters;met mediane diameters van 3,2 ± 0,1 μm.De mediane diameter van de populaties van GUV's geoogst uit nylon en polyester was 2,8 ± 0,2 μm voor beide populaties.

De cumulatieve distributiefunctie houdt rekening met de verdeling van diameters van een bepaalde populatie onafhankelijk van de totale omvang van de bevolking.Om rekening te houden met de significante verschillen in opbrengst, werden GUV-tellingen genormaliseerd op een massabasis per eenheid en de resulterende gegevens werden uitgedrukt op een logaritmische schaal voor GUV-nummer op de y-as (Fig.18).De semilogaritmische as biedt plaats aan het brede bereik in GUV -tellingen.De punten zijn het gemiddelde van de tellingen in elke bak van de drie experimenten voor elke stof.Per eenheid van lipide, produceerde Rayon de hoogste tellingen van GUV's van alle maten.Silk vertoonde een interessante dichotomie vanwege het samenspel tussen de verdeling in Guv -maten (Fig.17) en de opbrengst per lipide -eenheidsmassa (Fig.14).Binnen variatie van monster-tot-monsters produceerden zowel zijde als rayon vergelijkbare aantallen GUV's met diameters> 10 μm per μg afgezet lipide.Silk had echter minder GUV's diameters <10 μm per μg afgezette lipide in vergelijking met rayon.Katoen produceerde lagere tellingen van GUV's van alle groottes in vergelijking met zowel rayon als zijde, maar uitgewerkt polyester, wol en glasvezel.Nylon, hoewel het vergelijkbaar gemiddelde aantal GUV's als zijde produceert (Fig.14), had een lagere aantallen GUV's> 5 μm in vergelijking met zijde.Ongeveer 15% van de GUV's uit nylon was> 5 urn in diameter, terwijl ongeveer 31% van de GUV's van zijde> 5 urn waren.Wol produceerde de minste GUV's per μg afgezette lipide van alle soorten en maten.Over het algemeen produceerden de massa van lipide, rayon en zijden meer GUV's met grotere maten dan de andere stoftypen.Tabel 3 geeft een overzicht van het percentage grote blaasjes verkregen voor elk van de stoffen;en tabel 4 biedt mediane diameters van GUV -populaties verkregen van elk van de verschillende stoffen.

Het proces van vesicle-vorming op de stoffen was niet uniek voor DOPC, maar was algemeen voor andere lamellaire fase die amfifielen vormde, zoals het triblock copolymer polyoxyethyleen-polyoxyoxypropyleen-polyethyleen (peo5ppo67peo5, pluronic l121) en het diblockcopolymeerpoly (butadie-butadieen (butadie-butadieen (butadieen) PBD46PEO30.

Conclusies

Hierin wordt aangetoond dat de vorming van GUV's en polymersomen uit lamellaire films van fosfolipiden en amfifiele blokcopolymeren algemeen is voor een verrassend breed scala aan stoffen die bestaan ​​uit cilindrische vezels van verschillende oppervlaktechemistries.Alle stoffen produceerden populaties van GUV's met rechter-skewed unimodale distributies in diameters.Kwantitatieve karakterisering onthulde dat rayon- en zijden stoffen de hoogste opbrengst van GUV's met grotere maten produceerden.De hierin geleverde resultaten suggereren, zonder gebonden te zijn aan theorie, dat het mechanisme van de vorming van GUV's op papier, stoffen en andere vezelachtige poreuze media tot op zekere hoogte afhangt van de fysieke kenmerken van de vezels.Het buigen van de lamellaire stapels om te voldoen aan de kromming van de micrometerschaal van de cilindrische vezels is een gemeenschappelijk kenmerk in de stoffen.Empirisch gezien lijken verschillen in de oppervlaktechemie van de vezels de maten en opbrengsten van de populaties van GUV's te beïnvloeden.Vorming van GUV's op stoffen samengesteld uit cilindrische vezels van zeer verschillende chemie suggereert dat kromming een factor is bij het bevorderen van vesicle -vorming.Dienovereenkomstig, maar zonder te willen gebonden zijn aan theorie, is het mogelijk dat de kromming van de vezels vesiculatie bevordert - cylindrische geometrie is een gemeenschappelijk kenmerk van de vezels - wanneer verschillen in oppervlaktechemie en configuratie van de vezels in de stoffen in de stoffen de opbrengst enMaten van de blaasjes.

Voorbeeld 17: Vertraging en vervolgens het activeren van vesicle -vorming door de osmotische druk in de bulkoplossing te wijzigen

In dit voorbeeld wordt een methode om vesiculatie uit te stellen en vervolgens te activeren van een met amfifiel gecoate substraat in waterige oplossing bekendgemaakt.Om het lipide-gecoate nanofibrillaire cellulosesubstraat te verkrijgen, werd een stuk diameter van het nanopaper van 9,5 mm, gemaakt zoals hierboven beschreven (Voorbeeld 7), uitgesneden en vervolgens 10 μg DOPC: Topfluor-PC (99,5: 0,5 mol %) in chloroformwerd op het oppervlak afgezet met een glazen spuit.Het met lipide gecoate nanofibrillaire cellulosepapier werd 1 uur in vacuüm geplaatst om sporen van oplosmiddel af te drijven.Het door lipide gecoate substraat werd vervolgens in een kamer geplaatst die 100 microliter van een waterige oplossing bevat die 2 mM ficoll 400 bevatten. Deze concentratie ficoll werkt als een osmoliet die een osmotische druk uitoefent groter dan 1 kPa op de lipidelaag.De met lipide gecoate nanopaper werd 12 uur in deze oplossing geïncubeerd.Geen blaasjes gevormd op het oppervlak van het papier.Dus wanneer de osmotische druk die op de amfifiellaag wordt uitgeoefend groter is dan 1 kPa, blaas de amfifiellaag niet in een Ficoll -oplossing.De Ficoll 400 werd vervolgens verdund tot een concentratie van 0,2 mM door 900 microliter ultrazekering water aan de kamer toe te voegen.Blaasjes gevormd binnen 1 minuut na verdunning.Aldus werd de vorming van blaasjes geactiveerd door de osmoliet te verdunnen tot een concentratie die resulteert in een osmotische druk onder 1 kPa, waardoor blaasjes werden gevormd.Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

Voorbeeld 18: Vertraging en vervolgens het activeren van vesicle -vorming met behulp van temperatuur

In dit voorbeeld wordt een methode om vesiculatie uit te stellen en vervolgens te activeren van een met amfifiel gecoat substraat in waterige oplossing, met behulp van veranderingen in temperatuur, bekendgemaakt.Om het lipide-gecoate nanofibrillaire cellulosesubstraat te verkrijgen, werd een stuk diameter van het nanopaper van 9,5 mm, gemaakt zoals hierboven beschreven (Voorbeeld 7), uitgesneden en vervolgens 10 μg 1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine: topfluor: topfluor: topfluor: topfluor: topfluor: topfluor: topfluor:-PC (99,5: 0,5 mol %) in chloroform werd op het oppervlak afgezet met een glazen spuit.Het met lipide gecoate nanofibrillaire cellulosepapier werd 1 uur in vacuüm geplaatst om sporen van oplosmiddel af te dringen.Het door lipide gecoate substraat werd vervolgens in een kamer geplaatst die 100 microliter van een waterige oplossing bevatte die 100 mM glucose bevat bij 25 ° C en gedurende 5 uur te incuberen.Er werden na 5 uur geen blaasjes waargenomen op het oppervlak van de nanopaper.Wanneer de temperatuur werd verhoogd tot 35 ° C, met behulp van een Peltier -stadium, werden blaasjes gevormd binnen 1 minuut na de oplossing die 35 ° C bereikten.

Voorbeeld 19: Methode voor het toepassen van een amfifiele oplossing op substraten via aerosolen, sprays, glazen druppelaar, pipetten, weken

Een laboratoriumspuitfles werd gevuld met 10 ml van een oplossing van 1 mg/ml 0DOPC: topfluor-pc (99,5: 0,5 mol %) in isopropanol, en een stuk katoenen stof met 9,5 mm in diameter werd gespoten met deze oplossing voor een duurvan 1 sec.In een ander experiment werd een stuk katoenen stof met een diameter van 9,5 mm gedompeld in een 2 ml-oplossing van 1 mg/ml 0DOPC: TopFluor-PC (99,5: 0,5 mol %) in isopropanol.In beide gevallen mocht het substraat 2 minuten weken en werd vervolgens verwijderd en mocht hij drogen.

In aanvullende experimenten werd 10 microliter van een oplossing van 1 mg/ml 0DOPC: topfluor-pc (99,5: 0,5 mol %) in isopropanol afgezet op katoenstof met behulp van een glazen druppelaar of met behulp van een pluisroller.Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

Voorbeeld 20: Vorming van blaasjes op nanostructureerde cellulose -oppervlakken

Cellulosefilterpapier zijn vellen van willekeurig gepercoleerde cellulosevezels die vloeistoffen verduidelijken die erdoorheen stromen door gesuspendeerde deeltjes in micrometer-formaat kronkelige poriën te vangen.Alava & Niskanen (2006)Meldt prog.Phys.69: 669-723;Smook, G.,Handboek voor pulp- en papieren technologen, Tappi Press, 2016. Vanwege de inherente tortuositeit van deze artikelen, blijven veel van de GUV's die zich vormen op cellulosevezels gevangen in het filterpapier.Kresse et al.(2016)ACS Appl.Mater.Interfaces8: 32102-32107;Jij bent.(2018)BiomacromoleculenDoi: 10.1021/ascs.biomac.7b01645;Pazzi et al.(2019)Langmuir35: 7798-7804.Dit voorbeeld beschrijft de constructie van een cellulosepapier met kleinere poriën (nanocellulosepapier), waarvan het gebruik de GUV -verliezen als gevolg van het vangen minimaliseert en daarom de opbrengsten maximaliseert.Voor cellulosebladen gevormd door willekeurige percolatie van vezels, correleren vezel cross-over dichtheid en poriegroottes met de vezelgrootte.Alva & Niskanen, supra.Dienovereenkomstig resulteert het fabriceren van papier door de percolatie van nanoschaalvezels in een nanogestructureerd vel cellulose zonder micrometerschaalporiën die GUV's vangen.

Een nanostructureerd cellulosepapier (nanocellulose, nanopaper) werd vervaardigd voor gebruik als een substraat voor vesicle -vorming (papyrus) De eigenschappen van de nanocellulose en van de daarop gevormde blaasjes werden vergeleken met die van cellulosefilterpapier en commercieel verkrijgbaar traceerpapier.

Filter papier.Whatman asloze graad 42 filterpapier (42,5 mm diameter, 200 urn dikte), werd verkregen van Thermo Fischer Scientific (Waltham, Mass.).

Fabricage van nanopaper.Nanopaper werd gemaakt van nanocellulosepulp met behulp van oplossingsgieten in petrischalen.Klemm et al., Supra;Orsolini et al.(2015)ACS Appl.Mater.InterfacesDoe i: 10.1021/ACS AMI.5 nr. 08308;Horizon op nanoschaaldoi: 10.1039/c7nh00104e.Een 3% (w/v) waterige slurry van slurry van nanofibrillated cellulose werd verkregen van het Process Development Center van de Universiteit van Maine.Een glazen petrischaal met een diameter van 150 mm werd gevuld met 60 ml van een waterige suspensie van nanocellulose van 0,7 gew. %.Klemm et al., Supra;Orsolini et al.(2015)ACS Appl.Mater.InterfacesDoe i: 10.1021/ACS AMI.5 nr. 08308;Horizon op nanoschaaldoi: 10.1039/c7nh00104e.Het petrischaal werd 2 uur in een oven van 65 ° C geplaatst om het water te verdampen.De resulterende droge nanopaper verscheen als een dun en transparant vel met kleine rimpels vanwege de snelle verdampingssnelheid.Om de rimpels voor het afzetten van lipiden glad te strijken, was de petrischaal gevuld met 60 ml ultrazuiver water en het water mocht langzaam verdampen (ongeveer 12 uur) onder omgevingsomstandigheden.De afvlakkingsstap werd opnieuw herhaald om een ​​glad stuk nanopaper te verkrijgen.Nanocellulosepapier die op deze manier was gefabriceerd, was transparant, wat een visuele indicator opleverde dat het papier minimale luchtgevulde poriën had die licht verspreiden.Huang et al.(2013)ACS nano7: 2106-2113;Xu et al.(2016)Nanoschaal8: 12294-12306.

Overtrek papier.Er is extra gemak geassocieerd met het gebruik van veel beschikbare commerciële substraten op grondstoffenschaal.Aangezien een handtekening van een dicht beëindig papier met minimale poriën transparantie is voor licht, werd het traceringspapier van de kunstenaarkwaliteit (verkregen uit Amazon, Seattle, Wash.) Geselecteerd als een extra substraat uit het talloze bestaande commerciële papier en pulpproducten.Smook, supra.

Karakterisering van papieren oppervlakken.De oppervlakken van filterpapier, lab-gemaakt nanocellulosepapier (geproduceerd zoals hierboven beschreven) en commercieel traceringspapier werden gekenmerkt door scanning elektronenmicroscopie (SEM) op de micrometer en nanometer lengteschalen.SEM -afbeeldingen van de droge substraten werden verkregen met behulp van een veldemissiescanning -elektronenmicroscoop (Geminisem 500, Zeiss, Duitsland).De substraten werden gesneden in kleine vierkanten van 2 x 2 mm en gemonteerd op aluminium stubs met behulp van dubbelzijdige koperen tape.Een stuk koperen tape werd aan één rand op het substraat geplaatst en was verbonden met de stub om een ​​geleidingspad te creëren om opladen aan het oppervlak te minimaliseren.De bundelversnellingsspanning werd ingesteld op 1 kV.Een Everhart-Thornley secundaire elektronendetector werd gebruikt om de secundaire elektronen te verzamelen die zich van het oppervlak verspreiden.De lagere vergrotingsbeelden werden vastgelegd met een laterale pixelresolutie van 1,09 μm/pixel [1120 uM x 840 μm (1024 pixels x 768 pixels)], en de hogere vergrotingsbeelden werden vastgelegd met een laterale pixelresolutie van 45 μm/pixel [22.76μm × 17,07 μm (1024 pixels × 768 pixels)].

Fig.20A-20CToon SEM -afbeeldingen van de oppervlakken van de papieren bij lage vergroting.Zoals eerder opgemerkt (Kresse et al. (2016)ACS Appl.Mater.Interfaces8: 32102-32107;Pazzi et al.(2019)Langmuir35: 7798-7804), grote onregelmatige poriën die varieerden van verschillende micrometers tot enkele honderden micrometers in diameter bezaaid het oppervlak van filterpapier (Fig.20a).Het oppervlak van het lab-gemaakte nanocellulosepapier was daarentegen vrij van micrometerschaalporiën en leek glad op de micrometerschaal (Fig.20B).Het oppervlak van het traceerpapier was ook vrij van poriën van micrometerschaal, maar vertoonde afgeplatte cellulosevezels (aangegeven door witte pijlen) op het oppervlak (Fig.20c).De oppervlaktedichtheid van cellulose, berekend uit de SEM-afbeeldingen, was ˜90% voor filterpapier en ˜100% voor lab-gemaakt nanocellulosepapier en commercieel traceringspapier.Deze resultaten bevestigen dat zowel het lab-gemaakte nanocellulosepapier als het commerciële traceerpapier voldoen aan de gewenste criteria voor een nanogestructureerd cellulosepapier dat vrij is van poriën op micrometerschaal.

Hogere vergrotingsbeelden, getoond inFig.20d -20F, onthulde dat alle papieren, inclusief de micrometerschaalvezels van het cellulosefilterpapier, waren samengesteld uit fibrillaire nanocellulose.Poriën op nanoschaal waren aanwezig tussen de nanocellulosevezels (pijlen inFig.20d -20F.Aldus is filterpapier poreus op meerdere schalen, terwijl lab-gemaakt nanocellulosepapier en commercieel traceringspapier nanoschaalporositeit hebben.

Bereiding van papieren voor de vorming van de blaasjes.G42 Filterpapier, nanocellulosepapier en traceerpapiersubstraten werden bereid voor de vorming van de blaasjes door te weken in chloroform, met zachte agitatie, gedurende 30 minuten.De chloroform werd weggegooid en na een tweede chloroform van 30 minuten weken met zachte agitatie, werd het substraat verwijderd en mocht de chloroform verdampen.Na verdamping van de chloroform werd het substraat 30 minuten in ultrazekere water geplaatst;Het water weggegooid en een tweede water weken werd uitgevoerd.Nadat het tweede waterweek werd gedreven, werd het substraat verwijderd naar een glazen petrischaal, dat gedurende twee uur bij 65 ° C werd geïncubeerd.Eenmaal gedroogd, werden de papieren op kamertemperatuur bewaard.Papers die op deze manier werden behandeld ('schoongemaakte' papieren) handhaafden hun structuur en krimpen niet aanzienlijk.

Vesicle -vorming.Blaasjes werden gevormd op nanostructureerde papieren door 10 ul van een 1 mg/ml-oplossing van de zwitterionische fosfolipide dioleoyl-glycero-3-fosfocholine (DOPC) (DOPC) (DOPC) (DOPC) (DOPC) (DOPC) (DOPC) (DOPC) (DOPC) (DOPC) in chloroform op de cellulose-substraten te afzetten.De chloroform mocht sfeervol verdampen voordat de resterende sporen van oplosmiddel werden verwijderd door de substraten in een vacuümkamer gedurende minimaal 1 uur te plaatsen.Na verwijdering uit de vacuümkamer werd 150 ul van een 100 mm sucrose -oplossing afgezet op de oppervlakken van de gedroogde substraten en 2 uur geïncubeerd onder omgevingsomstandigheden.

In beeld brengen.Voor in situ confocale microscopie beeldvorming van de blaasjes op de substraten, werden de lipide-gecoate substraten, na twee uur van vesicle-groei, geplaatst in PDMS-pakkingen die waren aangebracht op glazen dia's (binnendiameter × hoogte = 12 × 1 mm) enwerden gehydrateerd in 150 ul groeibuffer.De kamer werd verzegeld met een glazen dekglip en confocale beelden werden verkregen door z-stapelbeelden te verzamelen met behulp van een 10 x plan-neofluar doelstelling met een numerieke opening van 0,3.Het afgebeelde gebied was 850,19 μm x 850,19 μm (2140 pixels x 2140 pixels) en de pinhole werd ingesteld op 1 luchtige eenheid, waardoor een confocale plakdikte van 5,86 μm was.Om de diepte-gecodeerde projecties te verkrijgen, werden gebieden van de blaasjes op elk substraat met afmetingen van 200 μm breedte x 200 μm lengte x 88 urn hoogte geselecteerd en werden een dieptekleurcoderingsproces toegepast op de afbeeldingen met behulp van ImageJ (NIH, Bethesda, Md.), Die elke plak een unieke kleur vals in plakjes en de plakjes samenvoegde om de diepte-gecodeerde projecties te maken.

Fig.20G-20iToon confocale afbeeldingen van lipide-gecoat filterpapier, lab-gemaakt nanocellulosepapier en traceerpapier na 2 uur incubatie in een 100 mm oplossing van sucrose.De confocale afbeeldingen zijn op dezelfde schaal als de SEM -afbeeldingen met lage vergroting (Fig.20A-20C) het bieden van ruimtelijke correlatie van de configuratie van de GUV's met de microstructuur van de papieren oppervlakken.GUV's gevormd als een dichte laag die het hele oppervlak van het lab-gemaakte nanocellulosepapier bedekte (Fig.20h) en commercieel traceringspapier (Fig.20i).De GUV's werden gestratificeerd in de axiale richting door grootte: kleinere GUV's waren dichter bij het papieroppervlak en grotere GUV's bevonden zich verder weg van het oppervlak.Alle GUV's hadden echter tethers naar de lipidefilm op het nanostructureerde papiersubstraat.Op regelmatig filterpapier waren GUV's alleen aanwezig op de discrete micrometerschaalvezels, inclusief op vezels diep in het filterpapier (Fig.20 g).Het nanocellulosepapier en traceerpapieroppervlakken hadden GUV's van een breed scala aan maten van 1 μm tot supergiant blaasjes ˜150 μm in diameter.Op regelmatig filterpapier waren GUV's groter dan 60 urn uiterst zeldzaam.

Observaties van de dynamiek van de vorming van de blaasjes (door time-lapse fotografie) op de oppervlakken van zowel het lab-gemaakte nanocellulosepapier als traceerpapier toonden aan dat grote blaasjes die werden gevormd door het samenvoegen van vesiculaire knoppen op de aangrenzende gebieden van de film van lipiden.Omdat de lipidefilms zich op discrete cellulosevezels ter grootte van een micrometer op filterpapier bevinden, waren GUV-diameters beperkt tot ongeveer de diameter van de vezels op filterpapier.Pazzi & Subramaniam (2018)Langmuir35: 7798-7804.Dit resultaat toont het belang van de contiguïteit van de lipidefilms voor het verkrijgen van GUV's van grotere diameters.

Vergelijkbaar met filterpapier, bevorderde lab-gemaakt nanocellulosepapier en commercieel traceerpapier de vorming van GUV's uit een breed scala aan amfifiele types zoals vetzuren, fosfolipiden, amfifilische diblock en triblock-copolymeren en complexe mengsels, waaronder extracten van plasma membranen en lipide composities die en lipide composities en lipide composities dievereisen hoge groeitemperaturen (Fig.21).

Voorbeeld 21: Vergelijking van GUV's gevormd op verschillende substraten in lage zout- en hoge zoutoplossingen

De hierin beschreven methoden voor blaasjesvorming (aangeduid als "papyrus") op nanostructureerde artikelen en andere soorten cellulose werden vergeleken met bestaande dunne-filmhydratatiemethoden voor vesicle-vorming.Deze omvatten elektroformatie op ITO-gecoate glazen objectglaasjes, gelondersteunde hydratatie op met agarose bedekte glazen glijbanen en een gemodificeerde vorm van zachte hydratatie op glazen dia's.

De vergelijkingen werden uitgevoerd onder drie omstandigheden: (1) groei van GUV's met behulp van DOPC in lage zoutoplossingen (zwitterionische membranen in lage zoutoplossingen), (2) groei van GUV's met behulp van DOPC in hoogzoutoplossingen (zwitterionische membranen in hoge zoutoplossingen),en (3) groei van GUV's met behulp van een mengsel van 97 mol % DOPC gedoteerd met 3 mol % PEG2000-PE in hoge zoutoplossingen (PEG-gestabiliseerde membranen in hoge zoutoplossingen).Deze specifieke voorwaarden werden gekozen omdat (a) de meeste gegevens die beschikbaar zijn over de groei van GUV's zijn op GUV's die zijn gekweekt in lage zoutoplossingen (Walde et al. (2010)Chembiochem11: 848-865;Stein et al.(2017)Frontiers in de fysiologie8: 1-16), (b) Groei van GUV's in hoge zoutoplossingen met een ionsterkte die overeenkomt met concentratie van ionen in fysiologische vloeistoffen is zeer wenselijk en is bekendVerhoog de opbrengsten van GUV's in hoge zoutoplossingen.Yamashita et al.(2002)Biochim.Biophys.1561: 129-134.

Voor lage zoutomstandigheden werden blaasjes gevormd in 100 mm sucrose.Voor hoge zoutomstandigheden (± PEG) werden blaasjes gevormd in standaard fosfaatgebufferde zoutoplossing (standaard PBS: 137 mM natriumchloride, 2,7 mm kaliumchloride, 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4-7,6) aangevuld met 100 mm sucrose.Voor elke techniek werden vijf onafhankelijke herhalingen uitgevoerd (n = 5) om statistische tests mogelijk te maken om rekening te houden met variaties in monster-naar-monster.Statistische significantie werd bepaald door het uitvoeren van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) op de fractionele opbrengsten van GUV's gemeten uit de vijf onafhankelijke herhalingen per techniek (groep) voor elk van de drie voorwaarden.Als ANOVA een statistisch significant verschil vertoonde, werden Tukey's eerlijk significante verschil (HSD) post-hoc tests uitgevoerd tussen de groepen.One-way ANOVA's en post-hoc HSD-tests werden ook uitgevoerd om de statistische significantie van de verschillen in fractionele opbrengsten van de technieken te bepalen onder de drie verschillende omstandigheden van groei (laag zout, hoog zout en hoog zout/PEG).Zie tabellen 6-17.

Voor de lage zoutconditie werden de volgende methoden en substraten gebruikt: papyrus op filterpapier, papyrus op nanocellulosepapier, papyrus op traceerpapier, papyrus op dextran-tracing-papier, elektroformatie op ITO-gecoate glazen dia's, gel geassisteerde hydratatie op agarose op agarose-Covered glazen glijbanen en gemodificeerde zachte hydratatie op glazen glijbanen.Papyrus op filterpapier, elektroformatie en gelondersteunde hydratatie werden uitgevoerd zoals beschreven.Pazzi et al.(2018)Langmuir35: 7798-7804;Walde et al.(2010)Chembiochem11: 848-865;Stein et al.(2017) supra;Horger et al.(2009) J. Amer.Chem.Soc.131: 1810-1819.

Dextran traceringspapier.Traceringspapier werd gedoteerd met dextran (dextran-tracing-papier) om de oplossing van polymeren uit de onoplosbare nanocellulosematrix na te bootsen.Het dextran-tracingpapier werd zo gefabriceerd dat de dextranconcentratie op het oppervlak van het papier de oppervlakteconcentratie van agarosemoleculen op het oppervlak van de glazen dekstoppen benaderde die wordt gebruikt voor agarosegelondersteunde hydratatie.Lage smelttemperatuur agarose heeft een gemiddeld molecuulgewicht van 100.000 (Roberts et al. (2011)J. Biomed.Mater.Res. - Deel B Appl.Biomater.99b: 158-169).Vanwege zijn porositeit absorbeert een stuk tracering met een gebied gelijk aan dat van een glasdeksels (22 mm x 22 mm) ˜120 μl water.Dienovereenkomstig werd 420 μl van een 1% (w/v) oplossing (in ultrazekere water) dextran (MW 100.000) afgezet op gereinigde stukken traceringspapier (d.w.z. traceringspapier twee keer gewassen met chloroform en water, zoals beschreven in voorbeeld20).De gecoate vellen traceerpapier werden op een vel Parafilm® geplaatst en verplaatst naar een hete plaat ingesteld op 40 ° C. waar het papier 3 uur mocht uitdrogen.

Papyrus op filterpapier, nanocellulose, traceerpapier en dextran-tracingpapier.Filterpapier (Whatman G42), nanostructureerde cellulose (nanocellulose of nanopaper) en traceerpapier werden gefabriceerd en gereinigd zoals beschreven in Voorbeeld 20. Circulaire schijven met een diameter van 9,5 mm van elk van de vier cellulose -substraten (G42 filterpapier, nanocellulosepapier,Traceringspapier en dextran traceringspapier) werden uit de gereinigde cellulose -substraten geslagen met behulp van een cirkelgatpunch (EK Tools Circle Punch, ⅜ in.).Lipiden werden afgezet op de substraten door 10 ul van de lipide-oplossing op de substraten te verspreiden en de met lipide gecoate substraten werden 1 uur in een standaard vacuümstiscator geplaatst om sporen van oplosmiddel te verwijderen.Vervolgens werden de met lipide gecoate substraten verplaatst naar individuele putten in een plaat van 48 putjes.Met een pipet werd 150 ul van een 100 mm sucrose -oplossing (laag zout of hoog zout) langzaam in de onderste hoek van de put uitgezet om het substraat volledig onder te dompelen in oplossing.De met lipide gecoate substraten mochten 2 uur in de oplossing incuberen.Om de blaasjes van het substraat te oogsten, werd de 150 ul oplossing 6 keer voorzichtig afgezogen met een gesneden pipetpunt.Overmatige aspiratie werd vermeden omdat de grote blaasjes gevoeliger zijn voor breuk van de afschuifkrachten, en in tegenstelling tot filterpapier of katoenen stof, zijn de blaasjes gemakkelijker losgemaakt.Bovendien werd tijdens aspiratie de pipetpunt niet in contact gebracht met het oppervlak;die de verwijdering van nanobuisjes of andere ongewenste lipide -aggregaten uit het substraat minimaliseert.

Elektroformatie.Elektroformatie werd in wezen uitgevoerd zoals beschreven.Herold et al.(2012)Langmuir28: 5518-5521.Indium tinoxide (ITO) gecoate glazen glijbanen (25 x 25 mm vierkanten, oppervlakteweerstand van 8-12 Ω/sq) werden verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.).In het kort werd 10 ul lipide-oplossing afgezet op een cirkelvormig oppervlak van een diameter van 9,5 mm in het midden van een schone indiumtinoxide (ITO) gecoate glazen glijbaan.De door lipide gecoate ito-gecoate glazen glijbaan werd vervolgens 1 uur in een standaard vacuümstismator geplaatst om sporen van oplosmiddel te verwijderen.Een cirkelvormige PDM's (polydimethylsiloxaan) pakking (binnendiameter x hoogte = 12 × 1 mm) werd aangebracht op het oppervlak van de dia om een ​​barrière rond de lipidefilm te construeren, die een kamer vormt.Vervolgens werd 150 ul van een oplossing (laag zout of hoog zout) toegevoegd in de pakking en een tweede ITO-gecoate glazen glijbaan werd bovenop de pakking geplaatst om een ​​kamer met gesloten sandebich te vormen.De ITO -oppervlakken waren verbonden met de kabels van een functiegenerator (33120A Agilent) met geleidende koperen tape.Een sinusoïdaal AC-veld bij een veldsterkte van 1,5 V/mm piek-tot-piek en frequentie van 10 Hz werd vervolgens gedurende 2 uur aangebracht.Na voltooiing van de groei werd de kamer gedemonteerd door de bovenste ITO -dia zachtjes te verwijderen.GUV's werden losgemaakt van het oppervlak van de schuif door de oplossing voorzichtig in de kamer te aspireren met behulp van een gesneden pipetpunt.

ITO-bedekte dia's degraderen bij elk gebruik, resulterend in lagere opbrengsten en kleinere blaasjesgroottes, en vereisen dus een milde gloeiing om de effecten van veroudering om te keren.Herold et al., Supra.(Deze snelle afbraak van een duur substraat is een verder nadeel van elektroformatie.) Vóór gebruik werden ITO-bedekte objectglaasjes gereinigd door 10 minuten te soniceren, opeenvolgend, in aceton, ethanol en ultrapure water.De dia's werden vervolgens gedroogd en gegloeid in lucht bij 150 ° C gedurende 20 minuten.

Gelondersteunde hydratatie.Gelondersteunde hydratatie werd in wezen uitgevoerd zoals beschreven.Horger et al.(2009)J. Amer.Chem.Soc.131: 1810-1819.In het kort, lage geleringstemperatuur agarosepoeder (conagische temperatuur 26-30 ° C) werd opgelost in een concentratie van 1% (w/v) in ultrazoegwater.Nadat de agarose was opgelost, werd 300 ul van de agarose -oplossing verspreid op vierkante glazen deksels (22 mm x 22 mm) die op Parafilm® werden geplaatst.De gecoate glazen deksels werden verplaatst naar een hete plaat ingesteld op 40 ° C, waar de agarosegel 3 uur mocht uitdrogen.Nadat de agarosegel was uitgedroogd, werd 10 ul lipide -oplossing verspreid op een gebied van 9,5 mm diameter van de agarosefilm en werd de film 1 uur onder vacuüm geplaatst.Om te hydrateren, werd een cirkelvormige PDMS -ring (binnendiameter x hoogte = 12 x 1 mm) aangebracht op de agarosefilm, 150 ul oplossing (laag zout of hoog zout) werd toegevoegd en de kamer was zorgvuldig bedekt met een glazen dekglip.

Aangepaste zachte hydratatie.Tien microliter van een oplossing van 1 mg/ml van DOPC: Topfluor-PC (99,5: 0,5 mol %) lipide, in nette chloroform, werd verspreid op een cirkelvormig oppervlak van de diameter van 9,5 mm in het midden van een premium glazen microscoopschuif (75 mm (75 mm (75 mm (75 mm (75 mm (75 mm (75 mM× 25 mm) met behulp van een glazen spuit (Hamilton).Het lipidenmengsel werd zachtjes verspreid met de naald van de spuit om een ​​dunne film met een groenachtige tint te verkrijgen.De met lipide gecoate glazen glijbaan werd 1 uur in een standaard vacuümuitreiking geplaatst om sporen van oplosmiddel te verwijderen.Een cirkelvormige PDMS -pakking (binnendiameter x hoogte = 12 × 1 mm) werd aan de dia aangebracht om een ​​barrière rond de lipidefilm te construeren.Vervolgens werd 150 ul oplossing (laag zout, hoog zout of hoog zout/pen) toegevoegd en was de kamer zorgvuldig bedekt met een glazen dekglip.Na 2 uur blaasjesgroei werd de dekslip verwijderd en werden GUV's losgemaakt van het oppervlak van de glijbanen door de oplossing voorzichtig te aspireren met behulp van een gesneden pipetpunt.De GUV -suspensies werden opgeslagen in een microcentrifugebuis tot verder gebruik.

Conventionele zachte hydratatie wordt typisch uitgevoerd met maximaal 20 mol % van anionische lipiden en incubatietijden van maximaal 24-48 uur.Akashi et al.(1996)Biophys.J71: 3242-3250.Het gebruik van een kortere incubatietijd voor gemodificeerde zachte hydratatie in deze experimenten biedt een basismaat voor de spontane vorming van GUV's van zwitterionische en PEG-gemodificeerde meerlagige stapels op een inert en ondoordringbaar oppervlak.

Stapte papyrus.Voor de vorming van blaasjes onder hoge zoutomstandigheden werd een extra tweestapsmethode ("getrapte papyrus") gebruikt waarbij depositie plaatsvond onder lage zoutomstandigheden (100 mM sucrose) en de ionsterkte werd vervolgens verhoogd tot hoge zoutomstandigheden (PBS).Stappen waren vergelijkbaar met de procedures voor blaasjesvorming op traceerpapier, behalve dat het papier gedurende 10 minuten werd gehydrateerd in 100 mm sucrose op een glazen schuif in een cirkelvormige PDMS -pakking (binnendiameter x hoogte = 12 × 1 mm).Na deze eerste stap werd 7,5 ul 20 x PBS -voorraadoplossing voorzichtig onder het papier uitgezet en werd een glazen dekglip geplaatst om de kamer te bedekken en de groei (in deze tweede stap) gedurende 2 uur voort te zetten.

Karakterisering van GUV's.GUV's gevormd onder laag zout, hoog zout en hoge zout-/pin -omstandigheden werden geoogst van alle substraten op identieke wijze en afgebeeld door confocale microscopie.GUV's met diameters variërend van 1 urn tot 150 urn werden waargenomen in de geoogste oplossingen.Kwalitatief leek het aantal geïsoleerde GUV's geoogst uit de substraten in hoge zoutomstandigheden lager dan het aantal GUV's dat werd geoogst uit de substraten in lage zoutomstandigheden.In hoge zoutoplossingen waren vlokken van GUV's aanwezig in populaties geoogst uit agarosegel, dextran-tracing papier en stapte-papyrus.Het aantal Flocs werd verminderd in populaties van GUV's gemaakt met behulp van PEG-gemodificeerde lipiden.Flocs, die gemakkelijk identificeerbaar waren, werden niet opgenomen in de kwantitatieve analyse.

Grootte -vergelijkingen.Histogrammen van de diameters van GUV's gevormd onder bepaalde van de hierboven beschreven omstandigheden worden getoond inFig.22.De vormen van de GUV -grootte histogrammen voor blaasjes gemaakt door papyrus op nanostructureerd papier en met zachte hydratatie waren vergelijkbaar, net als de histogrammen voor grootte van blaasjes gemaakt door alle geteste technieken: asymmetrisch met een prominente rechterstaart.Geen van de technieken resulteerde in de productie van een monodisperse populatie van GUV's.Het aantal GUV's in elke bak nam monotoon af als een functie van toenemende diameter.

De mediane diameter van de GUV's varieerde tussen 2 urn tot 3 μm.GUV's groter dan 15 micrometer waren minder dan 2% van de populatie GUV's verkregen uit alle technieken.This fraction, translates to 1,551 GUVs per μg lipid for PAPYRUS on nanocellulose paper, 1,717 GUVs per μg lipid for PAPYRUS on tracing paper, 1,301 GUVs per μg lipid for agarose gel-assisted hydration, 1,147 GUVs per μg lipid for electroformation, and 468 GUVsper μg lipide voor zachte hydratatie.Vergeleken met de verdeling van de groottes van GUV's die in lage zoutoplossingen worden gekweekt, werd een lager aantal GUV's van grotere maten verkregen na vesicle -vorming in hoge zoutoplossingen.

Papyrus over traceerpapier produceerde hogere of gelijk aantal GUV's in alle bakken in vergelijking met de andere technieken.

Berekening van fractionele opbrengst.De mol lipide die op het substraat worden afgezet (mol_D) wordt bepaald door

${\mathrm{mol}}_D=\; =\frac{M}{M}$

waarbij m de massa afgezette lipide in gram is en m het molecuulgewicht is.

Uit deze hoeveelheid lipiden worden N Guvs gevormd en geoogst in een volume van oplossing V_H.De mol lipiden in het membraan van een bolvormige gigantische unilamellaire blaasje I van gebied A₁is:

${\mathrm{mol}}_i=\; =\frac{2((4{\mathrm{Pi}((\frac{D_i}{2}))}^2))}{N_A{A}_{\mathrm{Hg}}}$

In deze vergelijking, n_Ais het nummer van Avogadro, een_Hgis het lipide -hoofdgroepsgebied en D_iis de diameter van blaasje i.De factor 2 verklaart het feit dat er 2 lipide folders in een dubbellaag zijn.

De totale mol lipide in N TGUV's uit een geoogste suspensie is dus:

${\mathrm{mol}}_{\mathrm{tot}}=\; =\frac{2\mathrm{Pi}}{N_A{A}_{\mathrm{Hg}}}\sum _{i=\; =1}^N{((D_i))}^2$

Constanten werden verzameld en uit de sommatie verhuisd.

Het effectieve opbrengst is dus

$\mathrm{Efficiëntie}=\; =\frac{2\mathrm{Pi}M}{N_A{A}_{\mathrm{Hg}}M}\sum _{i=\; =1}^N{((D_i))}^2$

Voor kwantificering van blaasjesaantallen en diameters, een hoeveelheid volume V_alwordt ontleend aan een geoogste ophanging V_H.De uiteindelijke uitdrukking voor de efficiëntie is dus:

$\mathrm{Efficiëntie}=\; =\frac{2\mathrm{Pi}M{V}_H}{N_A{A}_{\mathrm{Hg}}{\mathrm{MV}}_{\mathrm{al}}}\sum _{i=\; =1}^N{((D_i))}^2$

Merk op dat de som nu over het aantal van alle blaasjes is geteld in de beeldvormingskamer, n.De efficiëntie wordt vermenigvuldigd met 100 om een ​​percentage te bieden.Dienovereenkomstig werd de fractionele opbrengst Y van GUV's, voor elke methode, verkregen uit de diameters van GUV's geproduceerd door die methode met behulp van vergelijking 1:

$\begin{array}{cc}Y=\; =\frac{2\mathrm{Pi}{MV}_H}{N_A{A}_{\mathrm{Hg}}{\mathrm{MV}}_{\mathrm{al}}}{\sum }_{i=\; =1}^N{((D_i))}^2\times 100\mathrm{Reken}& ((1))\end{array}$

waarbij M de massa van lipide is afgezet op het substraat, m het molecuulgewicht van het lipide, v_alhet volume van de hoeveelheid in de beeldvormingskamer, v_HHet volume van de geoogste GUV -ophanging, n het aantal GUV's in de beeldvormingskamer, en D_iDe diameter van blaasje i.Fig.23toont een driedimensionale staafdop van de gemiddelde fractionele opbrengsten van GUV's verkregen uit elk van de technieken die zijn getest onder de drie omstandigheden (laag zout, hoog zout en hoog zout en pin).

Fractionele opbrengsten onder lage zoutomstandigheden.De gemiddelde fractionele opbrengsten voor blaasjes met zwitterionische membranen (d.w.z. blaasjes gemaakt met behulp van DOPC) in lage zoutoplossingen worden weergegeven in de achterste set bars inFig.23.Voor gemodificeerde zachte hydratatie was de gemiddelde fractionele opbrengst 16 ± 1%.In oplopende volgorde van fractionele opbrengsten, de gemiddelde opbrengsten van papyrus op filterpapier, elektroformatie, papyrus op dextran-tracing papier, agarosegel-geassisteerde hydratatie, papyrus op nanocellulosepapier en papyrus op traceerpapier waren 5 ± 1%, 21 ± 2%, 29 ± 3%, 29 ± 5%, 30 ± 5%en 30 ± 4%respectievelijk (Fig.23).Een evenwichtige eenrichtings-ANOVA toonde aan dat de verschillen tussen ten minste een van de gemiddelde fractionele opbrengsten statistisch significant waren [F (6, 28) = 39, p = 2,49 × 10⁻¹²].HSD post-hoc tests toonden aan dat de hogere gemiddelde fractionele opbrengsten van GUV's verkregen door agarosegelondersteunde hydratatie (p = 3,79 × 10⁻⁵), Papyrus op nanocellulosepapier (p = 1,50 × 10⁻⁵), Papyrus op traceerpapier (p = 1,11 × 10⁻⁵) en papyrus op dextran traceringspapier (p = 8,83 × 10⁻⁵) waren statistisch significant in vergelijking met zachte hydratatie.Deze resultaten tonen kwantitatief aan dat, in lage zoutoplossingen, agarosegel-geassisteerde hydratatie, papyrus op nanocellulosepapier, papyrus over traceerpapier en papyrus op dextran-tracing-papier de opbrengst van GUV's verbetert in vergelijking met de spontane vesiculatie van multibilay-stapels van DOPC.Zie tabellen 6 en 7.

De lagere gemiddelde fractionele opbrengst van GUV's verkregen door papyrus op filterpapier in vergelijking met gemodificeerde zachte hydratatie was statistisch significant (p = 2,45 x 10⁻⁴).Dit resultaat bevestigt het substantiële effect dat vangen op de fractionele opbrengst van GUV's oefent, zoals besproken in Voorbeeld 20. Het gebruik van artikelen en stoffen met grote poriën kan dus blaasjes behouden en de moleculen die ze inkapselen, binnen het papier.De gemiddelde fractionele opbrengst van GUV's verkregen uit papyrus op traceerpapier en papyrus op nanopaper was statistisch niet te onderscheiden (p = 1,00).Dit resultaat bevestigt dat de vorming van GUV's op lab-gemaakte nanocellulosepapier en commerciële traceerpapier, beide nanogestructureerde cellulosepapier zonder micrometerschaalporiën, vergelijkbaar waren.Verder waren de gemiddelde fractionele opbrengsten van papyrus over traceerpapier, papyrus op nanocellulosepapier, papyrus op dextran-tracing papier en agarosegel-geassisteerde hydratatie waren statistisch niet te onderscheiden van elkaar.

Interessant is dat elektroformatie geen statistisch significante hogere opbrengst opleverde dan zachte hydratatie (P = 0,43) over het bereik van blaasjesgroottes beschouwd als GUV's (> 1 μm).Elektroformatie produceert echter een hogere fractie van GUV's van grotere diameters in vergelijking met zachte hydratatie.Bovendien had elektroformatie een statistisch significante lagere fractionele opbrengst dan agarosegel-geassisteerde hydratatie (P = 0,00681), papyrus op nanopaper (P = 0,00265), papyrus op traceerpapier (P = 0,00191) en papyrus op dxtran-tracing-paper (P= 0,0169).Dit geeft waarschijnlijk aan dat het elektrische veld het samenvoegen van kleinere vesiculaire knoppen bevordert om GUV's van grotere diameters te vormen.De totale opbrengst van GUV's verkregen door elektroformatie is echter vergelijkbaar met die verkregen door zachte hydratatie.Dit resultaat is opmerkelijk, omdat papyrus op nanopaper, papyrus over traceerpapier en papyrus op dextran tracing-paper geen kostbare geleidende substraten, gespecialiseerde elektronische apparatuur of toegang tot elektriciteit vereisen, en de peroxidatie van lipiden niet veroorzaken.

Fractionele opbrengsten onder hoge zoutomstandigheden.De gemiddelde fractionele opbrengsten van GUV's voor zwitterionische membranen in hoge zoutoplossingen waren aanzienlijk lager voor alle technieken (Fig.23, middelste rij van bars).Veel van de fractionele opbrengsten waren ver onder de 5%.De gemiddelde fractionele opbrengst voor zachte hydratatie was 0,8 ± 0,8%, want elektroformatie was 1,1 ± 0,5%, voor papyrus op traceerpapier was 0,7 ± 0,2%, voor agarosegel-geassisteerde hydratatie was 2,2 ± 0,4%, voor dextran-tracingpapier was2,1 ± 1,2%, en voor stappapyrus was 5,6 ± 2,0%.Een evenwichtige eenrichtings-ANOVA toonde aan dat de verschillen tussen ten minste een van de gemiddelde fractionele opbrengsten statistisch significant waren [F (5, 24) = 5,8, p = 0,0012].HSD post-hoc tests toonden aan dat alleen de hogere gemiddelde fractionele opbrengst van een stappapyrus statistisch significant was in vergelijking met de andere technieken.Zie tabellen 8 en 9. Dus bij hoge zoutoplossingen opleverde geen van elektroformatie, agarose-gel geassisteerde hydratatie, papyrus op dextran-tracing papier en traceerpapier dat direct in PBS werd gehydrateerd in PBS, een verhoogde fractionele opbrengst van geïsoleerde GUV's vergeleken met zachte hydratatie,Een opmerkelijk contrast met de resultaten verkregen in lage zoutoplossingen.

Fractionele opbrengsten onder hoge zout/PEG -omstandigheden.Het opnemen van PEG-gemodificeerde lipide in het membraan leidde tot statistisch significante toename van de gemiddelde fractionele opbrengsten van geïsoleerde GUV's verkregen in hoge zoutoplossingen voor alle technieken, behalve voor gemodificeerde zachte hydratatie en papyrus op traceerpapier (Fig.23, Voorste set bars).De gemiddelde fractionele opbrengsten voor zachte hydratatie, papyrus over traceerpapier, elektroformatie, agarosegelondersteunde hydratatie, papyrus op dextran-tracingpapier en stapte-papyrus waren 0,8 ± 0,5%, 2,3 ± 1,2%, 4,7 ± 1,0%10,4 ± 2,1%, 7,7 ± 1,6%en respectievelijk 29,3 ± 1,8%.Een evenwichtige eenrichtings-ANOVA toonde aan dat de verschillen tussen ten minste een van de gemiddelde fractionele opbrengsten statistisch significant waren [F (5, 24) = 197, p = 1,14 × 10⁻¹⁸].HSD post-hoc tests toonden aan dat alle technieken statistisch significante toename van de opbrengst van geïsoleerde GUV's hadden in vergelijking met gemodificeerde zachte hydratatie.Zie tabellen 10 en 11. De opbrengsten van GUV's van agarosegelondersteunde hydratatie en papyrus op dextran-tracing-papier waren statistisch niet te onderscheiden (p-waarde = 0,14).De hogere opbrengst verkregen met behulp van deze twee technieken, vergeleken met die verkregen met behulp van papyrus op traceerpapier dat direct in PBS gehydrateerd was, was statistisch significant (p = 9,63 x 10⁻⁷) (P = 4.58 × 10⁻⁴).Merk op dat de opbrengst van PEG-gemodificeerde GUV's van agarosegelondersteunde hydratatie 2,8 keer lager was dan de opbrengst in lage zoutoplossingen (p = 7,29 × 10⁻⁶).De fractionele opbrengst daarentegen tussen getrapte-papyrus op traceerpapier in hoge zoutoplossingen en papyrus op nanostructureerde papieren in lage zoutoplossingen waren statistisch niet te onderscheiden (p-waarde = 0,607).Deze resultaten tonen aan dat, onder alle geteste technieken, papyrus op nanogestructureerd papier kwantitatief hogere opbrengsten produceerde in lage zoutoplossingen en stapte-papyrus op nanostructureerde papieren produceerden kwantitatief hogere opbrengsten in oplossingen met een hoge zout.

Van de omvangrijke hydrofiele pin-ketens bevestigd aan de hoofdgroepen van PEG-gemodificeerde lipiden is bekend dat ze afstotende hydratatiekrachten tussen dubbellagen verhogen.Een grotere afstotingskracht van de hydratatie zorgt ervoor dat de evenwichtsinterlamellaire afstand toeneemt in stapels met meerdere dag, hoewel het onduidelijk is of grotere evenwichtsafstanden zich vertalen in verhoogde vorming van de blaasjes.Het gebruik van PEG-gemodificeerde lipiden in zachte hydratatie, waarbij de dominante bijdrage aan de vorming van de blaasjes interbilayer is, leidde niet tot statistisch significante toename van de fractionele opbrengsten van GUV's in hoge zoutoplossingen in vergelijking met niet-PEG gemodificeerde lipiden.De resultaten geven dus aan dat verhoogde afstoting van de hydratatie onvoldoende is om aanzienlijke vesiculatie te veroorzaken wanneer elektrostatische afstotingen kort staan, consistent met de waarnemingen van anderen.Shohda et al.(2015)Biochem.Biophys.Rapporten3: 76-82;Horger et al.(2009)J Am.Chem.Soc.31: 1810-1819.

PEG-gemodificeerde lipiden daarentegen verhoogden de fractionele opbrengsten van geïsoleerde GUV's voor de agarosegelondersteunde hydratatie, stappapyrus en dextran-tracing papiertechnieken.Deze toename van fractionele opbrengsten correleerde met verminderde hoeveelheden flocculatie GUV's.Deze resultaten geven aan dat PEG-gemodificeerde lipiden de opbrengst van geïsoleerde GUV's in hoge zoutoplossingen verhogen door te fungeren als een sterische corona die voorkomt dat membranen floceren.Israelachvili, J. N.Intermoleculaire en oppervlaktekrachten: derde editie(2011).doi: 10.1016/C2011-0-05119-0.Beelden van het oppervlak van het substraat ondersteunen de opvatting dat de primaire rol van PEG bij het verhogen van de opbrengsten van geïsoleerde GUV's in hoge zoutoplossingen is door flocculatie te voorkomen.Uitgebreide regio's van flocculatie -GUV's waren bijvoorbeeld duidelijk voor zwitterionische membranen op traceerpapier na toevoeging van de geconcentreerde voorraad zouten.De PEG-gemodificeerde membranen daarentegen bleven als geïsoleerde GUV's na toevoeging van de geconcentreerde stockoplossing van zouten.

Concluderend resulteert papier-geschakelde lipidenhydratatie op nanostructureerde papieren in de hoogste fractionele opbrengst van gigantische blaasjes onder bestaande technieken onder zowel lage zout- als hoge zoutomstandigheden.Samen met de kwantitatieve verbeteringen is nanostructureerde papiergebaseerde papyrus kosteneffectief, vereist geen elektrische stroom of gespecialiseerde apparatuur en is het gemakkelijk te implementeren op zowel de bankop als op grotere schalen.

Voorbeeld 22: Kostenvergelijking voor de productie van GUV's met behulp van verschillende dunne filmhydratatietechnieken

Samen met kwantitatief superieure opbrengsten onder zowel lage zout- als hoge zoutoplossingen, onthullen de berekeningen van substraatkosten de aanzienlijke voordelen van het gebruik van papyrus op nanogestructureerd papier voor het opschalen van de productie van GUV's.Merk op dat voor een eerste benadering de productie van GUVS-schalen als een functie van het oppervlak van het substraat voor alle dunne-filmhydratatietechnieken.

Substraatkosten werden berekend met behulp van de laagst geposte prijzen van de websites van grote multinationale leveranciers van wetenschappelijk materiaal.Fig.24toont de substraatkosten per blaasje voor groei in lage zoutoplossingen en de substraatkosten per blaasje voor groei in hoge zoutoplossingen.Papyrus op basis van nanopaper heeft de laagste kosten per blaasje van alle maten voor groei in zowel lage zout- als hoge zoutoplossingen.Het produceren van een enkele Diameter van 100 μm met behulp van elektroformatie en agarosegelondersteunde hydratatie in lage zoutoplossingen kost bijvoorbeeld USD respectievelijk USD 0,16 en USD 0,002.De kosten zijn meer dan 100.000 × lager voor papyrus op traceerpapier (USD 0,0000013).

Voorbeeld 23: Economie van het opschalen van de productie van GUV's met behulp van dunne filmhydratatietechnieken

Een prototypisch voorbeeld van het produceren van 1 liter kunstmatig bloed wordt gebruikt om karakteristieke cijfers en maten van GUV's te schatten.Een gezonde volwassen man heeft ongeveer 5,5 L bloed dat voornamelijk bestaat uit erytrocyten met een gemiddeld corpusculair volume (MCV) van 91 μm³en concentratie van 4,92 × 10¹²erytrocyten/l.De MCV vertaalt zich in een equivalente gemiddelde bolvormige diameter van 5,6 μm.Het verkrijgen van een liter GUV's met een diameter tussen 5,0 en 5,9 μM bij een concentratie die typisch is voor bloed met behulp van de zachte hydratatietechniek vereist een glasoppervlak van 790 m²voor een bedrag van ongeveer USD 210.000 voor groei in lage zoutoplossingen.Vanwege de lagere opbrengst zou zachte hydratatie een glasoppervlak van 17.000 m vereisen²ten koste van ongeveer USD 4.600.000 als groei werd uitgevoerd in fysiologische zoutoplossing.(Alle substraatoppervlak en dollarhoeveelheden worden afgerond op 2 significante cijfers.) Elektroformatie zou een substraatgebied van 530 m vereisen²voor een bedrag van ongeveer USD 20.000.000 voor groei in lage zoutoplossingen en een oppervlakte van 4.300 m²ten koste van ongeveer USD 98.000.000 voor groei in fysiologische zoutoplossing (d.w.z. hoog zout).Als polymeerverontreiniging acceptabel is, zou een liter kunstmatige bloed die wordt geproduceerd door Agarose-gel geassisteerde hydratatie een substraatgebied van 620 m vereisen²ten koste van USD 190.000 voor groei in lage zoutoplossingen en een substraatoppervlak van 1.300 m²en USD 400.000 voor groei in fysiologische zoutoplossing.Productie met behulp van papyrus op dextran-tracingpapier heeft een lagere substraatkosten van USD 8.900, omdat zowel dextran als traceerpapier goedkoper zijn dan lage smelttemperatuur agarose en glazen deksels.

Bovendien zijn de kosten voor het produceren van kunstmatig bloed met behulp van papyrus op nanogestructureerd papier verschillende orden van grootte lager dan die van elektroformatie of agarosegelondersteunde hydratatie.Een liter kunstmatig bloed zou een stuk traceerpapier 250 m vereisen²in een gebied voor een bedrag van USD 190 voor groei in sucrose, en een oppervlakte van 210 m²ten koste van USD 160 voor stapt-Papyrus in fysiologisch zoutoplossing.Substraatkosten alleen verzwakken zachte hydratatie, elektroformatie en agarosegelondersteunde hydratatie voor het produceren van GUV's op grote schalen.

Naast het minst dure substraat voor eenmalig gebruik, de hoge treksterkte van nanocellulose (Klemm et al. (2011)Angew.Chemie - INT.Ed.50: 5438-5466) maakt traceringspapier veerkrachtig tegen mechanische beledigingen.Fig.25laat zien dat een enkel stuk traceerpapier minstens vijf keer kan worden gereinigd en hergebruikt zonder verandering in de fractionele opbrengst van de geoogste GUV's.Fig.26laat zien dat confocale beelden van blaasjes gevormd op traceerpapier na vijf cycli van de groei van de blaasjes niet te onderscheiden waren van beelden van blaasjes gevormd tijdens de eerste cyclus.(Zie Voorbeeld 6 voor methoden van cyclische groei.) Aldus kan het traceringspapier waarschijnlijk veel meer dan vijf keer worden hergebruikt, waardoor de vaste substraatkosten verder worden verlaagd.Bij elk gebruik zijn bij elk gebruik afgebroken en moeten door ITO gecoate dia's worden afgebroken en moeten gelmoleculen opnieuw worden toegepast, omdat ze oplossen in oplossing.

Voorbeeld 24: Laden van hydrofiele moleculen in blaasjes

Tien ul van een oplossing van 1 mg/ml van FITC-dextran en FITC werd afgezet op een cirkel met een diameter van 9,5 mm met gereinigd traceringspapier en het papier mocht drogen.19 ul van een oplossing van 1 mg/ml van DOPC werd op het papier aangebracht en het papier mocht opnieuw drogen.Het papier werd vervolgens twee uur in 150 ul 100 mm sucrose geplaatst.Blaasjes werden uit het papier geoogst door een zachte vloeistofstroom van een pipetpunt en bekeken door fluorescentie confocale microscopie.

Fig.27atoont een schema van de procedure.Fig.27Btoont confocale beelden van blaasjes met fluorescerende lumen, wat aangeeft dat de FITC-geladen dextran in blaasjes is opgenomen.

Voorbeeld 25: Functionalisering van het oppervlak van stofvezels met door water oplosbare verbindingen die in de blaasjes worden geladen en die gebonden blijven aan de vezels na herhaalde hydratatie- en uitdrogingsstappen

In dit voorbeeld werd een stof gefunctionaliseerd met een in water oplosbaar molecuul (FITC-dextran) voordat een oplossing van amfifiel op de stof wordt afgezet.De stof werd vervolgens blootgesteld aan water, gedroogd en vervolgens weer blootgesteld aan water.Het proces werd 3 keer herhaald.De stof werd vervolgens afgebeeld met een confocale microscoop om te bepalen of de blaasjes die worden gevormd die FITC-dextran worden gevormd.

Dienovereenkomstig werd 10 ul van een oplossing van 1 mg/ml van FITC-dextran in water op een cirkelvormig stuk zijden stof met een diameter van 9,5 mm geplaatst en 30 minuten gedroogd op een hete plaat op 40 ° C en vervolgens 10 ulvan een 1 mg/ml-oplossing van DOPC: rhodamine-PE (99,5: 0,5 mol %) in chloroform werd op de droge dextran-bedekte zijde geplaatst.De chloroform mocht verdampen.De droge zijden stof werd vervolgens bevochtigd met 50 ul water en mocht 10 minuten incuberen en vervolgens afgebeeld met een confocale microscoop.

Fig.28Atoont de aanwezigheid van vele met dextran gevulde blaasjes op de vezels van zijde.De concentratie van dextran in de blaasjes was veel hoger dan de concentratie van dextran in het omringende water, zoals blijkt uit de hoge fluorescentie -intensiteit in de blaasjes.Het water mocht 30 minuten verdampen tot droog, voordat 50 ul water aan de stof werd toegevoegd en 10 minuten liet incuberen en vervolgens werd afgebeeld met een confocale microscoop.Blaasjes hervormd op de vezels en gevangen de Dextran op als voorheen (Fig.28B).Het droog- en rehydratatieproces werd een derde keer herhaald en blaasjes hervormden opnieuw op de vezels (Fig.28C).Aldus blijven blaasjes die hoge concentraties dextran (een hydrofiel, in water oplosbaar molecuul) inknipt, geassocieerd met de vezels van de stof bij elke hydratatiestap.

Voorbeeld 26: het beheersen van de grootte van blaasjes en hun vrijgave uit substraten door de tortuositeit van de poriën op de substraten te beheersen

In dit voorbeeld werd het aantal blaasjes uit het substraat geregeld door het oppervlak van regulier filterpapier te behandelen met verschillende oppervlakte -concentraties van nanocellulose.

Puur filterpapier is een oppervlak met 0 g/mm²van nanocellulose en pure nanopaper is een oppervlak met 10,4 g/mm²van nanocellulose.Nanohybride papers (NHP) van oppervlaktedichtheid van 2,6 g/mm²en 5,2 g/mm²werden als volgt vervaardigd door vacuümfiltratie.Een cirkelvormig stuk graad 1 Whatman ™ -filterpapier met een diameter van maat 70 mm werd in een vacuümtrechter geplaatst en 40 ml nanocellulosesurry werd op de filterpapiercirkel gegoten.Om NHP te verkrijgen met een oppervlaktedichtheid van 2,6 g/mm², een 0,025 gew/V % slurry werd gebruikt.Om NHP te verkrijgen met een oppervlaktedichtheid van 5,2 g/mm², een slurry van 0,05 gew/V % werd gebruikt.Het filterpapier en de suspensie werden 30 minuten onder vacuüm gehouden totdat het papier volledig droog was en een mat van nanocellulosevezels aan het oppervlak van het filterpapier bleef.Fig.29a-29dToon SEM -afbeeldingen van de verschillende artikelen.Puur filterpapier (Fig.29a) had grote poriën.Pure nanopaper (Fig.29d) had geen poriën.NHP -papier (Fig.29B en 29c) hadden tussenliggende porositeiten.

Fig.29E-29HToon confocale afbeeldingen van DOPC -blaasjes op het papier na 2 uur groei in een 100 mm oplossing van sucrose.Puur filterpapier had de kleinste blaasjesgroottes en blaasjes waren aanwezig in de poriën van het papier (Fig.29e).Puur nanocellulosepapier had de grootste grootte van blaasjes en blaasjes waren alleen aanwezig op het oppervlak van het nanocellulosepapier (Fig.29h).De blaasjes gevormd op NHP -papier hadden tussenliggende grootte -kenmerken (Fig.29F en 29G).

Blaasjes werden geoogst uit deze artikelen en het aantal vrijgegeven blaasjes en hun maten werden gekwantificeerd.Fig.30atoont het aantal blaasjes dat uit de verschillende artikelen is vrijgegeven door vloeistofschaar.Puur filterpapier heeft het laagste aantal blaasjes vrijgegeven, wat aangeeft dat veel van de blaasjes gevangen blijven in het papier.Nanocellulosepapier heeft het hoogste aantal blaasjes vrijgegeven, wat aangeeft dat veel van de blaasjes in oplossing zijn vrijgegeven.De NHP -artikelen hadden een tussenliggende aantal vrijgegeven blaasjes die correleerden met de oppervlakteconcentratie van NHP.

Fig.30Blaat zien dat de afmetingen van de vrijgegeven blaasjes hoger zijn voor de nanocellulosepapieren en de NHP -papieren in vergelijking met filterpapier.Dit voorbeeld laat dus zien dat zowel de grootte van de gevormde blaasjes als de hoeveelheid vrijgegeven blaasjes kan worden geregeld door de oppervlakteconcentratie van nanocellulose te veranderen.

Voorbeeld 27: Gebruik van oplosbare polymeren om de vorming van de vesicle in omstandigheden met hoge zout te vergemakkelijken

De opbrengst van blaasjes gevormd op traceerpapier is extreem laag als het traceerpapier direct wordt gehydrateerd in oplossingen met> 10 mm monovalente zouten (hoge zoutoplossingen).Een middel om de opbrengst te verhogen, elders hierin beschreven, is om de groei van de blaasjes te beginnen onder lage zoutomstandigheden en vervolgens de zoutconcentratie te verhogen nadat de groei van de vesicle is begonnen.

Een andere methode voor het verhogen van de opbrengst van blaasjes onder hoogzoutaandoeningen, beschreven in dit voorbeeld, is het behandelen van het onoplosbare traceringspapiersubstraat met oplosbare polymeren.Hiertoe werd 420 ul van een oplossing van 1 mg/ml polymeer afgezet op een cirkel van 9,5 mm diameter van traceerpapier.De geteste polymeren waren hyaluronzuur natriumzout vanStreptococcus equi(1 mg/ml in water), carboxymethylcellulose (1 mg/ml in water), ficoll (1 mg/ml in water) en dextran (1 mg/ml in water).

De papieren werden 1 uur op een kookplaat van 40 ° C geplaatst om het water te verdampen.Na verdamping werd 10 ul van een 1 mg/ml-oplossing van DOPC: topfluorpc (99: 5: 0,5 mol %) in chloroform afgezet op de door polymeer gecoate papieren.De papieren werden gehydrateerd met 150 ul van een 1 x oplossing van standaard fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 2 uur.De papieren werden vervolgens afgebeeld met een confocale fluorescerende microscoop.Fig.31laat zien dat de oppervlakken van papieren die met elk van de vier polymeren zijn bedekt, bedekt waren met een hoge dichtheid van blaasjes, wat aangeeft dat de oplosbare polymeren oploven en zijn ingekapseld in de blaasjes.Deze methode biedt dus een middel om de blaasjes te laden met therapeutische polymeren zoals hyaluronzuren of smeerpolymeren, zoals carboxymethylcellulose.

Referenties

De volgende referenties, die hierin worden aangehaald, worden uitsluitend verstrekt om te helpen bij het begrijpen van de openbaarmaking en mogen niet worden beschouwd als stand van de techniek.

• (1) Walde, P.;Cosentino, K.;Engel, H.;Stano, P. Gigantische blaasjes: voorbereidingen en toepassingen.Chembiochem.2010, 848-865.
• (2) Dimova, R.;Aranda, S.;Bezlyepkina, N.;Nikolov, V.;Riske, K. A;Lipowsky, R. Een praktische gids voor gigantische blaasjes.Het sonderen van het membraan nanoregime via optische microscopie.J. Phys.Condens.Materie2006, 18, S1151-S1176.
• (3) Steer, D.;Leung, S. S. W.;Meiselman, H.;Topgaard, D.;Leal, C. Structuur van longmimetische multilamellaire lichamen met lipidesamenstellingen die relevant zijn in longontsteking.Langmuir2018, 34, 7561-7574.
• (4) Dietrich, C.;Volovyk, Z. N.;Levi, M.;Thompson, N. L.;Jacobson, K. Partitionering van THY-1, GM1 en verknoopte fosfolipide-analogen in lipide-vlotten gereconstitueerd in ondersteunde modelmembraanmonolagen.Proc.Natl.Acad.Sci.VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA.2001, 98, 10642-10647.
• (5) Veatch, S. L.;Keller, S. L. Scheiding van vloeibare fasen in gigantische blaasjes van ternaire mengsels van fosfolipiden en cholesterol.Biophys.J2003, 85, 3074-3083.
• (6) Roodbeen, R.;Van Hest, J. C. M. Synthetische cellen en organellen: compartimenteringsstrategieën.Biossays.2009, 1299-1308.
• (7) Blain, J. C.;Szostak, J. W. Vooruitgang naar synthetische cellen.Annu.Rev. Biochem.2014, 83, 615-640.
• (8) Schmitt, C.;Lippert, A. H.;Bonakdar, N.;Sandoghdar, V.;Voll, L. M. Compartimentering en transport in synthetische blaasjes.Voorkant.Bioeng.Biotechnol.2016, 4, 1-12.
• (9) York-Duran, M. J.;Godoy-Gallardo, M.;Labay, C.;Urquhart, A. J.;Andresen, T. L.;Hosta-Rigau, L. Recente ontwikkelingen in gecompartimenteerde synthetische architecturen als medicijndragers, celbedienden en kunstmatige organellen.Colloïden oppervlakken b biointerfaces2017, 152, 199-213.
• (10) Mulla, Y.;Aufderhorst-Roberts, A.;Koenderink, G. H. Synthetische cellen vormgeven.Phys.Biol.2018, 15.
• (11) Walde, P. Bouw kunstmatige cellen en protocell -modellen: experimentele benaderingen met lipide -blaasjes.Biossays.2010, 296-303.
• (12) Xu, C.;Hu, S.;Chen, X. Kunstmatige cellen: van basiswetenschap tot toepassingen.Mater.Vandaag2016, 19, 516-532.
• (13) Reeves, J. P.;Dowben, R. M. Vorming en eigenschappen van dunwandige fosfolipide blaasjes.J Cell.Physiol.1969, 73, 49-60.
• (14) Needham, D.;Evans, E. Structuur en mechanische eigenschappen van gigantische lipide (DMPC) blaasjes van 20 ° C onder tot 10 ° C boven de vloeibare kristal-kristallijne faseovergang bij 24 C.Biochemie1988, 27, 8261-8269.
• (15) Bagatolli, L. A.;Parasassi, T.;Gratton, E. Gigantische fosfolipide blaasjes: vergelijking tussen de hele lipidemonsterkenmerken met behulp van verschillende bereidingsmethoden - een twee fotonfluorescentiemicroscopieonderzoek.Chem.Phys.Lipiden2000, 105, 135-147.
• (16) Akashi, K.;Miyata, H.;Itoh, H.;Kinosita, K. Bereiding van gigantische liposomen in fysiologische omstandigheden en hun karakterisering onder een optische microscoop.Biophys.J.1996, 71, 3242-3250.
• (17) Kubsch, B.;Robinson, T.;Steinkihler, J.;Dimova, R. Fasegedrag van geladen blaasjes onder symmetrische en asymmetrische oplossingsomstandigheden die worden gecontroleerd met fluorescentiemicroscopie.J Vis.Exp.2017, nr. 128, 1-17.
• (18) Angelova, M. I.;Dimitrov, D. S. Liposome -elektroformatie.Faraday bespreekt.Chem.Soc.1986, 81, 303-311.
• (19) Horger, K. S.;Estes, D. J.;Capone, R.;Mayer, M. Films van agarose maken een snelle vorming van gigantische liposomen mogelijk in oplossingen van fysiologische ionensterkte.J. Am.Chem.Soc.2009, 131, 1810-1819.
• (20) Weinberger, A.;Tsai, F. C.;Koenderink, G. H.;Schmidt, T. F.;Itri, R.;Meier, W.;Schmatko, T.;Schroder, A.;Marques, C. Gel-geassisteerde vorming van gigantische unilamellaire blaasjes.Biophys.J.2013, 105, 154-164.
• (21) López Mora, N.;Hansen, J. S.;Gao, Y.;Ronald, A. A.;Kieltyka, R.;Malmstadt, N.;KROS, A. Bereiding van grootte instelbare gigantische blaasjes van verknoopte dextran (ethyleenglycol) hydrogels.Chem.Commun.2014, 50, 1953-1955.
• (22) Mora, N. L.;Gao, Y.;Gutierrez, M. G.;Peruzzi, J.;Bakker, i.;Peters, R. J. R. W.;Siewert, B.;Bonnet, S.;Kieltyka, R. E.;Van Hest, J. C. M.;et al..Evaluatie van dextran (ethyleenglycol) hydrogelfilms voor gigantische unilamellaire lipidenblaasjesproductie en hun toepassing voor de inkapseling van polymersomen.Zachte materie2017, 13, 5580-5588.
• (23) Movsesian, N.;Tittensor, M.;Dianat, G.;Gupta, M.;Malmstadt, N. Gigantische lipideblaasjesvorming met behulp van dampafgooide geladen poreuze polymeren.Langmuir2018, 34, 9025-9035.
• (24) Peruzzi, J.;Gutierrez, M. G.;Mansfield, K.;Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-geassisteerde gigantische unilamellaire blaasjesvorming van onverzadigde lipidesystemen.Langmuir2016, 32, 12702-12709.
• (25) Kresse, K. M.;Xu, M.;Pazzi, J.;Garcia-Ojeda, M.;Subramaniam, A. B.;Garcia-Ojeda, M.;Subramaniam, A. B. Nieuwe toepassing van cellulosepapier als een platform voor de macromoleculaire zelfassemblage van biomimetische gigantische liposomen.ACS Appl.Mater.Interfaces2016, 8, 32102-32107.
• (26) Li, A.;Pazzi, J.;Xu, M.;Subramaniam, A. B. Cellulose Abetted Assembly en tijdelijk ontkoppelde lading van lading in blaasjes gesynthetiseerd uit functioneel diverse lamellaire fasevormende amfifielen.Biomacromoleculen2018, 19, 849-859.
• (27) Dominak, L. M.;Keating, C. D.;Dominak, L. M. Polymeer -inkapseling in gigantische lipideblaasjes.Langmuir2007, 23, 7148-7154.
• (28) Tsai, F. C.;Stuhrmann, B.;Koenderink, G. H. Inkapseling van actieve cytoskelet-eiwitnetwerken in liposomen ter grootte van cellen.Langmuir2011, 27, 10061-10071.
• (29) Dominak, L. M.;Omiatek, D. M.;Gundermann, E. L.;Heien, M. L.;Keating, C. D. Polymere drukte -middelen verbeteren de passieve biomacromolecuulinkapseling in lipide -blaasjes.Langmuir2010, 26, 13195-13200.
• (30) Estes, D. J.;Mayer, M. Giant Liposomen in fysiologische buffer met behulp van elektroformatie in een stroomkamer.Biochim.Biophys.Acta - Biomembr.2005, 1712, 152-160.
• (31) Peterlin, P.;Arrigler, V. Elektroformatie in een stroomkamer met oplossingsuitwisseling als een manier voor het bereiden van slappe gigantische blaasjes.Colloïden oppervlakken b biointerfaces2008, 64, 77-87.
• (32) Nieth, A.;Verseux, C.;Bamert, S.;Suss, R.;Romer, W. Een eerste stap in de richting van liposoom-gemedieerde intracellulaire bacteriofaagtherapie.Deskundige opinie.Drug Deliv.2015, 5247, 1-14.
• (33) Singla, S.;Harjai, K.;Raza, K.;Wadhwa, S.;Katare, O. P.;Chibber, S. fosfolipide blaasjes ingekapseld bacteriofaag: een nieuwe benadering om de faagbiodistributie te verbeteren.J. Virol.Methods 2016, 236, 68-76.
• (34) Buddingh ', B. C.;Van Hest, J. C. M. Kunstmatige cellen: synthetische compartimenten met levensechte functionaliteit en adaptiviteit.ACC.Chem.Res.2017, 50, 769-777.
• (35) Paleos, C. M.;Tsiourvas, D.;Sideratou, Z.;Pantos, A. Vorming van kunstmatige multicompartment vesosoom en dendrosoom als gepratedeerde dragers van geneesmiddelen en genafgifte.J. Controle.Uitgave2013, 170, 141-152.
• (36) Stachowiak, J. C.;Richmond, D. L.;Li, T. H.;Brochard-Wyart, F.;Fletcher, D. A. Inkjet-vorming van unilamellaire lipide-blaasjes voor celachtige inkapseling.Laboratoriumschip2009, 9, 2003-2009.
• (37) Szoka, F.;Papahadjopoulos, D. Vergelijkende eigenschappen en voorbereidingsmethoden van lipide -blaasjes (liposomen).Ann.Rev Biophys.Bioang1980, 9, 467-508.
• (38) Dominak, L. M.;Keating, C. D. Macromoleculaire drukte verbetert polymeer -inkapseling in gigantische lipideblaasjes.Langmuir2008, 2, 13565-13571.
• (39)Katoen: wetenschap en technologie,1e ed.;Gordon, S., Hsieh, Y. L., Eds.;Woodhead Publishing: Cambridge, 2007.
• (40) Li, Y.-y.;Wang, B.;Ma, M.-G.;Wang, B. Beoordeling van recente ontwikkeling bij voorbereiding, eigenschappen en toepassingen van op cellulose gebaseerde functionele materialen.Int.J Polym.Sci.2018, 2018, 1-18.
• (41) Alava, M.;Niskanen, K. De fysica van papier.Meldt prog.Phys.2006, 69, 669-723.
• (42) Dullien, F.Poreuze media: vloeistoftransport en poriënstructuur,2e ed.;Brenner, H., Ed.;Academic Press: San Diego, 1991.
• (43) Bogaty, H.;T., C. F. Meting van watersnelheid van water door filterpapier.J. Res.Natl.Bur.Stellage.(1934).1944, 33, 353-362.
• (44) Rodriguez, N.;Pincet, F.;Cribier, S. Gigantische blaasjes gevormd door zachte hydratatie en elektroformatie: een vergelijking door fluorescentiemicroscopie.Colloïden oppervlakken b biointerfaces2005, 42, 125-130.
• (45) Pereno, V.;Carugo, D.;Bau, L.;Sezgin, E.;Bernardino de la Sema, J.;Eggeling, C.;Stride, E. Elektroformatie van gigantische unilamellaire blaasjes op roestvrijstalen elektroden.ACS Omega2017, 2, 994-1002.
• (46) Zupanc, J.;Drasler, B.;Bolte, S.;King-Iglic, V.;Naalden, a.;Erdogmus, D.;Tiny, D. Lipide -blaasje vormanalyse van populaties met behulp van lichte videomicroscopie en computer vision.PLOS One2014, 9, 1-14.
• (47) Dimitrov, D. S.;Angelova, M. I. Lipide zwelling en liposoomvorming op vaste oppervlakken in externe elektrische velden.1987, 56, 48-56.
• (48) Greene, A. C.;Henderson, I. M.;Gomez, A.;Paxton, W. F.;Vandelinder, V.;Bachand, G. D. De rol van membraanfluïdisatie in de ge-geassisteerde vorming van gigantische polymersomen.PLOS One2016, 11, J 0158729.
• (49) Faysal, K. M. R.;Park, J. S.;Nguyen, J.;Garcia, L.;Subramaniam, A. B. Lipidebilagen zijn lang leven op oplosmiddel gereinigde plasma-geoxideerd poly (dimethyl) siloxaan (OX-PDMS).PLOS One2017, 12, 1-16.
• (50) Lu, C.;Lu, Y. H.;Shen, Y. G.;Mai, Y. W. Log-normale nanograine-formaatverdelingen in nanostructureerde composieten.Philos.Mag. Lett.2008, 88, 829-836.
• (51) Teran, A. V.;Bill, A.;Bergmann, R. B. Tijd-evolutie van korrelgrootteverdelingen in willekeurige nucleatie- en groeicristallisatieprocessen.Phys.Rev. B - Condens.Materie mater.Phys.2010, 81, 1-19.
• (52) Kostoglou, M.;Lioudbas, J.;Karapantsios, T. Een populatiebalansbehandeling van bubbelgrootte evolutie in vrij drainerende schuimen.Colloïden oppervlakken een fysicochem.Eng.Adder.2015, 473, 75-84.
• (53) Tenchov, B. G.;YANEV, T. K. Weibull -verdeling van deeltjesgroottes verkregen door uniforme willekeurige fragmentatie.J Colloid Interface Sci.1986, 111, 1-7.
• (54) Hosoda, K.;Matsuura, T.;Suzuki, H.;Yomo, T. Oorsprong van lognormale-achtige distributies met een gemeenschappelijke breedte in een groei- en divisieproces.Phys.Eerwaarde E - Stat.Niet -lineaire, zachte materie Phys.2011, 83, 1-5.
• (55) Best, A. C. De grootteverdeling van regendruppels.Quarterly Journal of the Royal Meteorological Society.1950, pp 16-36.
• (56) Letters, E. Vernieuwde krachtwetten: een hulpmiddel voor het begrijpen van aggregatiepatronen bij dieren?2000, 90-94.
• (57) Bergmann, R. B.;Bill, A. Over de oorsprong van logaritmisch-normale distributies: een analytische afleiding en de toepassing ervan op nucleatie- en groeiprocessen.J Cryst.Groei2008, 310, 3135-3138.
• (58) Limpert, E.;Stahel, W. A.;ABBT, M. Log-normale distributies over de wetenschappen: sleutels en aanwijzingen.2001, 51, 341-352.